エキソーム解析における難読領域を標的とする解読法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Personal genome-based initiatives toward understanding bran diseases
• Project/Area Number: 25129706
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 工藤 純 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (80178003)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: エキソーム / ゲノム / 次世代シーケンサー / バイオテクノロジー / 遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではエキソーム解析における難読領域を対象として、その解読技術の開発を目指した。SureSelectを用いて得られたエキソーム解析の724kbからなる難読領域の多くはGC含量が高い(67.8%)配列であった。この難読領域を解読するためにHaloPlexターゲットエンリッチメントシステムによる難読領域の増幅と解読を試みた。約724kb/19,715カ所全体を標的としたところ約709kb(97.96%)の標的領域を計63,886個のAmplicon(シーケンス長計4.7Mb)として増幅するHaloPlexプローブライブラリーが作成できた。このライブラリーを用いて全ゲノムDNAから標的領域のDNAを増幅し、回収したDNA断片を次世代シーケンサーで平均カバレッジ256倍で解読したところ、709kbの標的領域のうち約83％について10倍以上の厚みで解読に成功した。これにより、エキソーム解析の大部分を解読することが可能になった。HaloPlex法でも解読できなかったGC含量が高い(78.4%)難読領域は、125kb/3500個所であった。難読領域長は長いものから100番目で178bp（合計24.2kb）、500番目で80bp（合計70.9kb）、1000番目で40bp（合計100kb）、1500番目で22bp（合計115.2kb）となり、当然のことながら、解析数を増やしても、その割には解読できる領域が長くなる訳ではなかった。長いものから順に、96組のPCRプライマーの設計を試みたところ、設計の成功率78％(96/123箇所)で、領域サイズは、421～167bp（合計21,518bp）となった。GC含量は、65/96で80％以上、89/96が70％以上と高かった。これら96組のプライマーを用いたPCRの結果、83/96(86%)で増幅が認められ、解読も可能であるものと思われる。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。