反応速度論的パラメーター測定のためのイメージング基盤技術構築

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Establishment of Integrative Multi-level Systems Biology and its Applications
• Project/Area Number: 25136706
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 青木 一洋 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80511427)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: FRET / レンチウイルス / レトロウイルス / 組換え

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、高感度FRETバイオセンサーのレンチウイルスライブラリーの構築を中心に行う。
高感度FRETバイオセンサーのレンチウイルスライブラリーの構築：申請者は、生きた細胞内において高い時間・空間分解能で活性を測定することができる分子内FRETバイオセン
サーの高感度化とハイスループット構築の手法を開発した。しかしながら、これまでレトロウイルス、レンチウイルスによるFRETバイオセンサーの導入は蛍光タンパク質間の高頻度な組換えによって不可能であった。この問題を克服するために、遺伝子合成によりYFPとCFPの相同性を敢えて減らした蛍光タンパク質ペアを人工的に作製し、FRETバイオセンサーの遺伝子導入を可能とさせることを試みた。
(1-A) YFPとCFPの相同性を減らした蛍光タンパクペアの開発：上記の目的のために、相同性を減らしたYFPを作製した。大腸菌のコドンに最適化されているYPet遺伝子を用いた。意外なことに、大腸菌のコドンに最適化したYPetの発現量は、ヒトのコドンに最適化したYPetとほぼ同等の蛍光強度を示すことが分かった。この大腸菌コドン化YPetを用いることで、レトロウイルス、レンチウイルス共にYFPとCFP遺伝子間で組み換えを起こさないことを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実施計画書の予定通り、YFP遺伝子のコドンをヒトから大腸菌に最適化することで、レンチウイルス、レトロウイルスによるFRETバイオセンサーの遺伝子導入を行うことができるようになった。

Strategy for Future Research Activity

今後は、大腸菌コドン化したYPetにヒトコドン化した領域を導入して組換えが起きるかどうかを検討する。また数理モデルの構築も行う。