2014 Fiscal Year Annual Research Report
高速AFMを用いたKaiタンパク質の複合体形成過程のダイナミクス観察
Publicly Offered Research
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
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| Project/Area Number |
26102515
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
内橋 貴之 金沢大学, 数物科学系, 教授 (30326300)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 一分子イメージング / 走査型プローブ顕微鏡 / 高速原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
KaiAとKaiBのKaiCへの結合は, KaiC単量体にある2ヶ所のリン酸化部位のリン酸化状態に依存することが知られている。そこで, リン酸化をミミックする変異体（S431D）と脱リン酸化をミミックする変異体（S431A/T431A）に対して, KaiAおよびKaiBとの複合体形成を観察した。
リン酸化あるいは脱リン酸化KaiCを配向制御して基板に固定し, 観察溶液にKaiAを加えて観察を行った。リン酸化変異体では, CI側へのKaiAの結合は全く見られなかった。一方, CII側ではKaiAが結合と解離を繰り返す様子が見られた。KaiAのKaiCへの結合時間を解析したところ, 時定数約0.9 s 程度でKaiCから解離することがわかった。脱リン酸化KaiCでもKaiAのCI側への結合は見られなかったが, CII側へのKaiAの結合時間が大幅に伸び, ほとんど解離しないことがわかった。KaiAがKaiCのCII側にのみ結合することは, いろいろな手法によりこれまで提唱されてきたモデルと一致するが, KaiCのリン酸化状態に依存して結合時間が変わることを初めて明らかにした。
次に, KaiCとKaiBの相互作用について調べた。リン酸化KaiCでは, KaiBのCII側への結合は観察されたが, その頻度は非常に少なく数秒で解離した。一方, CI側ではKaiBのモノマーがKaiC六量体リングにリング状に結合することがわかった。KaiBがリング状に結合しているKaiCと1個も結合していないKaiCの両方が存在することから, KaiBのKaiCへの結合に何らかの協同性があることが示唆された。脱リン酸化KaiCではCIとCIIの両ドメインに対して明らかなKaiBの結合は見られなかった。KaiBのKaiCへの結合に関して, これまでCI側とCII側のどちらに結合するか, 相矛盾する実験データが提示されていたが, 今回の高速AFM観察からCI側に結合することが明瞭に示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
KaiCの配向制御した基板への固定法が予想より早く確立でき、KaiAとKaiC、KaiBとKaiCの相互作用部位やリン酸化状態に依存した相互作用の変化など、当初予想した以上の結果が得られたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
生化学的手法によりKaiCのリン酸化・脱リン酸化の概日周期測定を行いながら同時並行で高速AFM観察を行い、分子間相互作用と概日周期との関係を明らかにする。
また、基板でのKaiCの拡散を制御して、KaiC六量体のモノマー交換過程の観察を進める。
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