2015 Fiscal Year Annual Research Report
高速AFMを用いたKaiタンパク質の複合体形成過程のダイナミクス観察
Publicly Offered Research
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
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| Project/Area Number |
26102515
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
内橋 貴之 金沢大学, 数物科学系, 教授 (30326300)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 一分子計測(SMD) / 蛋白質 / 走査プローブ顕微鏡 / ナノバイオ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までにKaiAはKaiCのCIIリング側のみに結合でき、リン酸化KaiCには結合解離を繰り返し、脱リン酸化KaiCには長時間結合することを明らかにした。本年度は、KaiC-KaiA間の相互作用をさらに詳細に調べため、試験管中にKaiA/KaiB/KaiCとATPを混合し、一定時間ごとに試験管から取り出して、KaiCを基板に吸着した状態でKaiAとの相互作用を観察した。その結果、KaiAがKaiCに結合した後に解離するまでの解離速度定数(Koff)がKaiCのリン酸化状態に同期して24時間周期で振動することを見出した。さらに、KaiCの二ヶ所のリン酸化部位(S431, T432)それぞれに対してリン酸化と脱リン酸化状態をミミックした変異体(KaiC-ST, KaiC-SpT, KaiC-pSpT, KaiC-pST)へのKaiAの結合解離を観察し、S431のリン酸化状態がKaiAとの相互作用に最も影響を及ぼしていることもわかった。
一方、 KaiBに関してはリン酸化KaiCのCIIリングにも結合することを前年度に明らかにしたが、これについても本年度さらに検討を進めた。リン酸化KaiCが自己脱リン酸化されていく過程で、KaiCに結合するKaiBの分子数を調べたところ、最初は結合分子数は脱リン酸化とともに増加し、約５時間後をピークに減少に転じることがわかった。電気泳動によるKaiCの二ヶ所のリン酸化部位における自己脱リン酸化過程と比較したところ、KaiBのKaiCへの親和性もS431のリン酸化状態に依存していることがわかった。また、KaiCと親和性を高くした変異体KaiBでの測定から、KaiBモノマーはKaiC六量体のサブユニットに協同的に結合することを明らかにした。
これらの成果はKaiタンパク質の分子間相互作用を一分子レベルで解析し、さらに、分子の結合と解離が概日周期と直接的に相関していることを示した初めての例であり、現在、国際共同研究を通じて数理計算による詳細な解析を進めており、高速AFM解析と合わせて概日周期の分子機構に迫れるものと期待される。
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| Research Progress Status |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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