2014 Fiscal Year Annual Research Report
内在性mRNAの一分子イメージングによるRNA代謝機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Molecular Science for Nanomedicine |
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| Project/Area Number |
26107704
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岡部 弘基 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20455398)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | mRNA / 一分子イメージング / RNA代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではこれまでに開発したアンチセンスプローブによる内在性mRNAの定量的検出法を応用することにより、内在性mRNAの一分子イメージング法を開発し、これにより細胞内RNA代謝のダイナミクスとメカニズムを詳細に明らかにすることを目的としている。
生細胞内におけるmRNAの一分子可視化は、アンチセンスプローブを結合させ、高感度定量的イメージング法により検出することとした。まず、GAPDH mRNAを標的として、そのコーディング領域の予測二次構造に基づき複数の候補プローブを設計した。次に、細胞内アンチセンスプローブの拡散速度の定量解析から標的mRNAとの結合を評価した。光褪色後蛍光回復（FRAP）による細胞内拡散の定量的解析から、各プローブの結合特性を定量的に決定した。得られた結合能に関する結果に対して、アンチセンスプローブ配列と結合能を詳細に考察した結果、プローブ配列と結合能についての一般則を見出し、これに基づいて新規にアンチセンスプローブ候補を設計したところ、プローブ候補は高い確率で優れた結合能を示したことから、この知見が効率良くプローブを設計に関する際の指針となることを確認した。
次に、高親和性アンチセンスプローブを用いた細胞内mRNAの一分子検出に取りくんだ。mRNA由来の信号を高い信号－背景比で検出するために、複数のアンチセンスプローブを用いたり、アンチセンスプローブを標識する蛍光色素の種類や細胞内イメージング条件を詳しく検討することにより、COS7細胞の細胞質内GAPDH mRNAの一分子イメージングに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的である細胞内のmRNAに対するアンチセンスプローブの開発と一分子イメージング法の開発に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、開発した細胞内mRNAの一分子イメージング法を用いることにより、細胞内において個々のmRNAが受ける分解や翻訳抑制といった転写後調節反応を細胞内において直接観察する。まずmRNAの翻訳活性制御を観察するため、ストレス環境において形成するストレス顆粒（SG）内のmRNAの一分子追跡に応用する。これまでにストレス依存的な顆粒形成にともなう翻訳抑制を発見しており、本研究では、この現象においてmRNA を一分子で直接観察することにより、mRNA のダイナミックな翻訳制御の時空間的パラメータを決定する。さらにその後はmRNAの配列特異的分解といった代謝のイメージングを行う。
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[Journal Article] A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging2014
Author(s)
Uno S, Kamiya M, Yoshihara T, Sugawara K, Okabe K, Tarhan MC, Fujita H, Funatsu T, Okada Y, Tobita S, Urano Y
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Journal Title
Nat. Chem.
Volume: 6
Pages: 681-689
DOI
Peer Reviewed
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