2014 Fiscal Year Annual Research Report
PV陽性GABA細胞－グリアtripartite synapse細胞外糖鎖の役割
Publicly Offered Research
| Project Area | Deciphering sugar chain-based signals regulating integrative neuronal functions |
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| Project/Area Number |
26110705
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 細胞外糖鎖 / GABA / グリア / ペリニューラルネット / 塩素イオン / パルブアルブミン / GAD67 / 母体ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. PV陽性GABA細胞選択的脱落モデルのtripartite synapseと細胞外糖鎖の検討：GAD67ヘテロ欠損（GAD67+/GFP）胎仔の母体にストレスをかけた出生仔を生後21日目に屠殺し、脳切片を作成し、抗PV抗体、抗GFAP抗体、Wisteria floribunda agglutinin（WFA）染色の３重免疫染色を行った。海馬と内側前頭皮質でPV陽性GABA細胞が選択的に減少しており、それに伴って、perineuronal net (PNN)陽性細胞が有意に減少していたが、WFA染色強度に有意差は無かった。また、PNNを伴わないPV陽性GABA細胞も減少していた。
2. PV陽性GABA細胞選択的に蛍光蛋白を発現するマウスの作製：PV-Cre transgenicマウスとレポーターマウスを交配し、PV陽性GABA細胞選択的にtdTomatoまたはEGFPを発現させる予定であったが、京都大学よりPV/myrGFP-LDLRct BAC transgenicマウスの譲渡を受けることができたので、PV陽性GABA細胞選択的にEGFPを発現する確率がより高い（90％以上）このマウスを使用することにした。
3. PV陽性GABA細胞-アストロサイトtripartite synapse同定と細胞外糖鎖除去法確立：脳スライス標本を作製し、sulforhodamine 101(SR 101)で約20分間インキュベートすると、アストロサイトに選択的にSR 101が取り込まれた。これによりPV陽性GABA細胞（GFP）アストロサイト（SR101）のtripartite synapseを同定できるモデルの作成に成功した。スライスをchondroitinase ABCで1-2時間還流したのち固定して、PNNが除去されたことをWFA染色法で確認できた。これによりPNNが電気生理学特性に与える影響を解析するモデルの作成に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画ではPV-Creトランスジェニックマウスとレポーターマウスを交配し、PV陽性GABA細胞選択的に蛍光を発現するマウスを作製する予定であったが、PV陽性GABA細胞選択的に、しかもより高い確率で蛍光（GFP）を発現するマウスを入手することができた。しかもこのPV/myrGFP-LDLRct BAC transgenicマウスはホモ接合体なので、繁殖が容易で、かつ他の蛍光を発現するマウスとの交配で、PV細胞と他の細胞（例えばアストロサイト）を同時に同定することも可能となるので、このマウスを使用することにした。予定の大部分を実行でき、上記以外は特に予定した計画の大きな変更もなく、残りの計画を今年度で達成する目途ができた。学会や論文としての公開も順調にできている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．PV陽性GABA細胞と細胞外糖鎖が選択的に脱落したモデルの行動解析：GAD67ヘテロ欠損（GAD67+/GFP）胎仔の母体にストレスをかけると、生後にPV陽性GABA細胞とPNNが選択的に内側前頭皮質で減少する。このモデルの以下の行動解析を行う。認知機能評価：空間的参照記憶課題で場所学習機能を評価し、さらに報酬コーナーを変える逆転学習課題を行う。また、空間的作業記憶課題を与えて、空間認知における作業記憶障害の評価を行う。衝動性・注意機能評価：報酬に対してランダムに遅延時間が挿入され、反応時間の潜時で衝動性・注意機能を評価する。また、遅延価値割引課題でさらに詳しく衝動性を評価する。
２．PV陽性GABA細胞選択的脱落モデルの細胞外糖鎖の種類と局在の解析：上記モデルの切片を作成し、抗PV抗体、WFA染色法（PV細胞の一部のPNNを認識）、抗アグリカン抗体（PNN全般を認識）を用い、PV陽性／陰性細胞各々のPNNの種類を解析し、細胞種によるPNN種の違いと脱落状態を解析する。
３．細胞外糖鎖脱落したモデルの電気生理学的解析：PV陽性GABA細胞蛍光（GFP）マウス脳スライスをchondroitinase ABC （0.1 unit/mL）で1－2時間還流してPNNを除去し、自発性GABA作動性シナプス後電流の頻度や振幅・decayなどを解析する。あるいは、１．のモデルの脳波を解析する。
４．PV陽性GABA細胞と細胞外糖鎖が選択的に脱落したモデルの網羅的DNAメチル化解析：１．のモデルの脳組織を回収し、PBAT／RRBS法で、次世代シーケンサーを用いて網羅的DNAメチル化解析を行い糖鎖合成酵素の変化を解析する。
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[Journal Article] Activation of glycine receptors modulates spontaneous epileptiform activity in the immature rat hippocampus.2014
Author(s)
Chen, R., Okabe, A., Sun, H., Sharopov, S., Hanganu-Opatz, I.L., Kolbaev, S.N., Fukuda, A., Luhmann, H.J.and Kilb, W.
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Journal Title
The Journal of Physiology
Volume: 592
Pages: 2153-2168
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Roles of taurine-mediated tonic GABAA-receptor activation in radial migration of neurons in the developing cerebral cortex.2014
Author(s)
Furukawa, T., Yamada, J., Akita, T., Matsushima, Y., Yanagawa, Y. and *Fukuda, A.
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Journal Title
Frontiers in Cellular Neuroscience
Volume: 8
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Functional deficiency of MHC class I enhances LTP and abolishes LTD in the nucleus accumbens of mice.2014
Author(s)
Edamura, M., Murakami, G., Meng, H., Itakura, M., Shigemoto R., Fukuda, A. and Nakahara, D.
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 9
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Functional regulation of neuronal K+-Cl−cotransporter KCC2.2015
Author(s)
Watanabe, M., Iwata, S., Furukawa, T., Kumada, T., Uchida, T., Hirose, S. and Fukuda, A.
Organizer
第92回日本生理学会大会
Place of Presentation
神戸国際会議場・展示場（兵庫県・神戸市）
Year and Date
2015-03-23
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[Presentation] Maternally-derived ambient taurine plays a pivotal role in radial migration in the embryonic mouse neocortex by tonically activating GABAA receptors.2014
Author(s)
Fukuda, A., Furukawa, T., Yamada, J., Akita, T., Matsushima, Y., Yanagawa, Y.
Organizer
第37回日本神経科学大会
Place of Presentation
パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
Year and Date
2014-09-12
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