オートファジー不全を伴う慢性膵炎発症メカニズムの解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Multidisciplinary research on autophagy: from molecular mechanisms to disease states
• Project/Area Number: 26111516
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 大村谷 昌樹 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (60398229)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: Autophagy / Chronic pancreatitis

Outline of Annual Research Achievements

遺伝性膵炎の原因遺伝子SPINK1のノックインマウスを樹立し、解析を行った。SPINK1ノックインマウスは正常に出生し、生後4週でヒト慢性膵炎と類似の病態が完成することが判明した。慢性膵炎を発症する過程で、① オートファジー不全、② p62の蓄積、③ 膵内トリプシン活性の亢進、④細胞死（アポトーシス、ネクローシス）を確認した。この結果は、オートファジー不全に伴うp62の蓄積とトリプシンの異所性（膵内）活性化が、細胞死を引き起こし、慢性膵炎の発症に深く関与することを示唆している。そこで、これらの要因がどのように関連しているのかを明らかにするため、①膵特異的Atg5欠損マウス、②カテプシンB欠損マウス（トリプシンの活性化を抑制するマウス）、③プログラムされたネクローシスの実行因子receptor-interacting protein kinase 3 (RIP3)欠損マウスとの二重変異マウスを解析した。評価指標として、膵内のオートファジー活性（LC3-II、p62、カテプシン活性）、膵内トリプシン活性、4週齢における慢性膵炎の重症度（線維化、炎症細胞の浸潤等）をSPINK1 ノックインマウスと比較した。その結果、Atg5との二重変異マウスではその重症度に差が見られなかった。オートファジー不全と同様の原因と考えられた。カテプシンB欠損マウスとの交配では、トリプシン活性が上昇しており、このマウスにおけるトリプシノーゲンの活性化にはカテプシンBを介する以外の経路が働いていることを示唆している。Rip3との二重変異マウスでは、その重症度が抑制され、このネクローシスが膵炎発症に重要であることが判明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

① 膵特異的Atg 5欠損マウス、② 膵特異的p62欠損マウスおよび膵特異的p62過剰発現マウス、③ カテプシンB欠損マウスとの二重変異マウスを計画していたため、①、③は解析が終了し、まもなく投稿を予定している。②は本年度（平成27年度）に行う。
オートファジー制御化合物の探索（単離腺房細胞を用いたex vivo解析）は、現在膵腺房細胞の培養系を構築している段階である。今年度、化合物スクリーニングを行うシステムを用いて、化合物をスクリーニングし、オートファジーの制御化合物を探索する計画である。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度において、SPINK1ノックインマウス（慢性膵炎マウス）とAtg5, CathepsinB, Ripk3ノックアウトマウスとの二重変異マウスの解析は終了し、投稿に向けて準備中である。今年度は慢性膵炎発症過程におけるp62タンパクの機能解析を行う。これはSPINK1 knock-in;p62flox/flox;Ptf1a-creマウスを樹立し、線維化の程度、膵内の炎症マーカーを指標に解析する計画である。
本年度は、これまでのin vivo研究に加え、in vitroの培養系を構築し、オートファジー制御化合物の探索を行う。膵腺房細胞の細胞株は存在しないため、マウスの胆管からコラゲナーゼを膵内に逆流させ、細胞を単離する。この単離腺房細胞（GFP-LC3(+)）の培養液中にコレシストキニンを加え、オートファジーを誘導する。オートファジーの定量はGFPを指標にするが、あらかじめ、用意している化合物（共同研究者から供与していただく）を加えておき、GFP蛍光が増強、または減弱する化合物をスクリーニングする計画である。また、同時に腺房細胞内トリプシン活性も測定する。

Research Products

• [Journal Article] Staging laparoscopy leads to rapid induction of chemotherapy for unresectable pancreatobiliary cancers. (2015)
  • Author(s): Hashimoto D, Chikamoto A, Sakata K, Nakagawa S, Hayashi H, Ohmuraya M, Hirota M, Yoshida N, Beppu T, Baba H.
  • Journal Title: Asian J Endosc Surg. Volume: 8 Pages: 59-62
  • DOI: doi: 10.1111/ases.12138.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. (2015)
  • Author(s): Nakagawa, Y., Sakuma, T., Sakamoto, T., Ohmuraya, M., Nakagata, N. and Yamamoto, T.
  • Journal Title: BMC Biotechnol. Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] SPINK1 Status in Colorectal Cancer, Impact on Proliferation, and Role in Colitis-associated Cancer (2015)
  • Author(s): Ida, S., Ozaki, N., Hirashima, K., Zaitsu, Y., Taki, K., Sakamoto, Y., Miyamoto, Y., Oki, E., Morita, M., Watanabe, M., Maehara, Y., Yamamura, K., Baba, H. and Ohmuraya, M.
  • Journal Title: Mol Cancer Res. Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical features and management of pancreatic solid pseudopapillary tumor. (2014)
  • Author(s): Tsukamoto, M., Hashimoto, D., Chikamoto, A., Abe, S., Ohmuraya, M. and Baba, H.
  • Journal Title: Am Surg. Volume: 80 Pages: 1212-1215
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation and analysis of serine protease inhibitor Kazal type 3-Cre driver mice. (2014)
  • Author(s): Sakata, K., Ohmuraya, M., Araki, K., Suzuki, C., Ida, S., Hashimoto, D., Wang, J., Uchiyama, Y., Baba, H. and Yamamura, K.
  • Journal Title: Exp Anim. Volume: 63 Pages: 45-53
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Autophagy regulation in pancreatic acinar cells is independent of epidermal growth factor receptor signaling. (2014)
  • Author(s): Ozaki, N., Fukuchi, Y., Tomiyoshi, SR., Uehara, H., Ida, S., Wang, J., Araki, K., Sibilia, M., Baba, H., Yamamura, K. and Ohmuraya, M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 446 Pages: 224-230
  • DOI: doi: 10.1016/j.bbrc.2014.02.111.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Application of Oocyte Cryopreservation Technology in TALEN-Mediated Mouse Genome Editing. (2014)
  • Author(s): Nakagawa, Y., Sakuma, T., Nakagata, N., Yamasaki, S., Takeda, N., Ohmuraya, M. and Yamamoto, T.
  • Journal Title: Exp Anim. Volume: 63 Pages: 349-355
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Pancreatic cancer in the remnant pancreas following primary pancreatic resection. (2014)
  • Author(s): Hashimoto, D., Chikamoto, A., Ohmuraya, M., Sakata, K., Miyake, K., Kuroki, H., Watanabe, M., Beppu, T., Hirota, M. and Baba, H.
  • Journal Title: Surg Today. Volume: 44 Pages: 1313-1320
  • DOI: doi: 10.1007/s00595-013-0708-0.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pancreaticodigestive anastomosis and the postoperative management strategies to prevent postoperative pancreatic fistula formation after pancreaticoduodenectomy. (2014)
  • Author(s): Hashimoto, D., Chikamoto, A., Ohmuraya, M., Hirota, M. and Baba, H.
  • Journal Title: Surg Today. Volume: 44 Pages: 1207-1213
  • DOI: doi: 10.1007/s00595-013-0662-x.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of Postoperative Weight Loss on Survival After Resection for Pancreatic Cancer. (2014)
  • Author(s): Hashimoto, D., Chikamoto, A., Ohmuraya, M., Abe, S., Nakagawa, S., Beppu, T., Takamori, H., Hirota, M. and Baba, H.
  • Journal Title: JPEN J Parenter Enteral Nutr. Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed
• [Presentation] オートファジー不全と慢性膵炎発症メカニズムの解明 (2014)
  • Author(s): 大村谷昌樹,坂田和也,高城克暢,松元美由紀,荒木喜美,山村研一
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜、横浜市、神奈川県
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] SPINK insufficiency causes impaired autophagy resulting in chronic pancreatitis. (2014)
  • Author(s): Ohmuraya, M., Sakata, K., Mareninova, O., Notohara, K., Gukovsky, I., Gukovskaya, A.
  • Organizer: 2014 APA/JPS 45th Anniversary Meeting
  • Place of Presentation: Hapuna Beach Prince Hotel、ハワイ島、米国
  • Year and Date: 2014-11-05 – 2014-11-08
• [Presentation] SPINK不全に伴うオートファジーの異常と慢性膵炎の発症 (2014)
  • Author(s): 大村谷昌樹
  • Organizer: 第22回若手膵臓研究会
  • Place of Presentation: 生田神社会館、神戸市、兵庫県
  • Year and Date: 2014-10-22 – 2014-10-22
• [Presentation] オートファジー不全と慢性膵炎発症メカニズムの解明 (2014)
  • Author(s): 大村谷昌樹
  • Organizer: 第23回日本Cell Death学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京医科歯科大学、東京都
  • Year and Date: 2014-07-18 – 2014-07-19
• [Presentation] 急性膵炎におけるオートファジー選択的基質p62の役割 (2014)
  • Author(s): 大村谷昌樹,能登原憲司,廣田昌彦
  • Organizer: 第45回日本膵臓学会
  • Place of Presentation: 北九州国際会議場、北九州市、福岡
  • Year and Date: 2014-07-11 – 2014-07-12