神経細胞内の異常なリソソームとオートファゴソームの関わりについての遺伝学的研究

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Multidisciplinary research on autophagy: from molecular mechanisms to disease states
• Project/Area Number: 26111519
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 小池 正人 順天堂大学, 医学研究科, 教授 (80347210)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: オートファジー / リソソーム / LC3 / 凍結超薄切片法 / p18/LAMTOR1 / ragulator / オリゴデンドロサイト / 髄鞘形成不全

Outline of Annual Research Achievements

ユトレヒト大学医学部細胞生物学/Cell Microscopy Coreとの共同研究により、凍結超薄切片法を用いたオートファゴソームのマーカーLC3の免疫電顕に関する条件検討を行った。蛍光抗体法で内在性のLC3を認識することが知られている数種類の抗体を用いて、GFP-LC3を強制発現したHela細胞を用いて免疫電顕を行ったところ、コスモバイオ社のマウスモノクロナール抗体のみが使用可能であることが分かった。そこでこの抗体を用いて内在性のLC3の局在解析を試み、パラホルムアルデヒドのみの固定の細胞においてある程度標識が可能であることを確認した。さらに、凍結超薄切片のオートファゴソームの構造保持のため、切片回収の溶液に脂質を固定する作用を持つウランを加えたところ、より良好な像が得られることがわかった。しかし、この回収法では内在性のリソソーム膜タンパク質lamp1の抗原性が消失するため、酸性コンパートメントの標識はBSA-goldの取り込みなど他の方法を用いる必要があることが明らかとなった。
リソソーム膜タンパク質p18/LAMTOR1の中枢神経系における役割の遺伝学的検討のため、p18コンディショナルノックアウト(p18F/F)マウスと小脳プルキンエ細胞特異的にCreを発現するGluD2-Creノックインマウスを交配したが、小脳プルキンエ細胞特異的p18欠損マウスは小脳症状を呈さず、長期生存することがわかった。一方、p18F/FマウスとNestin-Creマウスを交配して得た中枢神経系特異的p18欠損マウスは生後14日齢で死に至ることがわかった。組織化学的、超微形態解析により同マウスでは髄鞘がほとんど認められないことがわかった。このことはNestinプロモーターが発現する細胞のうちオリゴデンドロサイトの系列の細胞がp18の欠損の影響を最も受けやすいことを強く示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

オートファジーの免疫電顕による詳細な解析においては、LC3の単染色ではなくLC3と他のオルガネラマーカーとの多重染色が必須であるが、従来LC3の免疫電顕に多用されていた包埋前染色法では多重染色が困難であった。一方、凍結超薄切片法では多重染色が可能であるが、これまでに容易に手に入るLC3抗体を用いた安定的な検出法に関する報告はほとんどなかった。しかし、本年度に行ったユトレヒト大学のグループとの共同研究の結果、多重染色の免疫電顕によるオートファゴソームと他のオルガネラとの関係を解析するための条件が整った。
p18/LAMTOR1は培養細胞レベルではエンドソームないしオートファゴソームとリソソームとの融合に必須であるため、同分子の欠損は神経細胞に大きな影響を与えると予想し、GluD2-Cre、Nestin-Creマウスと交配した。しかし神経細胞における同分子の欠損の影響は大きなものではないと考えられた。しかし、中枢神経系特異的p18コンディショナルノックアウトマウスの解析結果から、当初の予想と異なり、p18の欠損は神経細胞よりもオリゴデンドロサイト系列に大きな影響を及ぼすことで、髄鞘形成不全という極めて重篤な症状を呈することが明らかになった。この結果はmTORC1のリソソーム膜表面での活性化に必須なp18/LAMTOR1がオリゴデンドロサイト系列の分化成熟に決定的な影響を及ぼすことを初めて示すものである。このような重要な所見を見い出すことが出来た点で、当初の予想とは異なるものの順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今回習得したLC3の凍結超薄切片法による免疫電顕を利用して、最近得られた内在性DFCP1に対する抗体との二重染色を行うとともに、光顕-電顕相関観察によるオートファゴソームとオートリソソームの免疫電顕と蛍光タグ標識像の同時観察を試みる。
p18が神経幹細胞からオリゴデンドロサイト系列への分化に必須である可能性を考え、p18F/F;Nestin-Creマウスおよび対称群より神経幹細胞を採取し、in vitroの系で神経細胞・アストロサイト・オリゴデンドロサイト諸系列への分化効率の相違を検討するとともに、ラパマイシンなどmTORC1の系統に影響を与える各種薬剤投与実験を行う。さらに、p18が成熟オリゴデンドロサイトの維持に必須か否かを検討するため、成熟オリゴデンドロサイトにおいてCreを発現するMBP-Cre(入手済)との交配によりp18F/F;MBP-Creマウスを作製し、白質における髄鞘形成について対称群と比較するとともに、Curprizoneなどの薬剤投与による脱髄後の再髄鞘化の遅延の有無を比較する。
カテプシンD欠損マウスにおける異常なリソソームの生化学的検討を行うため、同マウスより安定的にリソソームを採取する方法を確立しつつあるが、終末期の同マウスからは対称群と質的にほとんど変化のないリソソームしか回収できないことが明らかとなった。このことは、終末期の同マウスの異常なリソソームは既存の方法と全く異なる方法で採取する必要があることを示している。そこで、ユビキチン化や界面活性剤に対する不溶性などを利用した特異的な採取法の検討を進めるとともに、蓄積しているリソソームそのものに質的な異常が生じていない可能性のあるより早期の同マウスより同様の方法でリソソームを採取し生化学的に比較検討を行う。

Research Products

• [Journal Article] L-carnitine enhances axonal plasticity and improves white-matter lesions after chronic hypoperfusion in rat brain (2015)
  • Author(s): Ueno, Y., Koike, M., Shimada, Y., Shimura, H., Uchiyama, Y., Hattori, N., Urabe, T
  • Journal Title: J. Cereb. Blood Flow Metab. Volume: 35 Pages: 382-91
  • DOI: doi: 10.1038/jcbfm.2014.210
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Iron induces mitochondrial damage that recruits parkin (2015)
  • Author(s): Asano, T.*, Koike, M.*, Sakata, S., Takeda, Y., Nakagawa, T., Hatano, T., Ohashi, S., Funayama, M., Yoshimi, K., Asanuma, M., Toyokuni, S., Mochizuki, S., Uchiyama, Y., Hattori, N., Iwai, K (*These authors contributed equally to this work)
  • Journal Title: Neurosci. Lett. Volume: 588 Pages: 29-35
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2014.12.052
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition (2015)
  • Author(s): Nori, S., Okada, Y., Nishimura, S., Sasaki, T., Itakura, G., Kobayashi, Y., Renault-Mihara, F., Shimizu A., Koya, I., Yoshida, R., Kudoh, J., Koike, M., Uchiyama, Y., Ikeda, E., Toyama, Y., Nakamura, M., Okano, H
  • Journal Title: Stem. Cell Rep. Volume: 4 Pages: 360-73
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2015.01.006
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Three-dimensional architecture of podocytes revealed by block-face scanning electron microscopy (2015)
  • Author(s): Ichimura, K., Miyazaki, N., Sadayama, S., Murata, K., Koike, M., Nakamura, K., Ohta, K., Sakai, T
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 5 Pages: 8993
  • DOI: 10.1038/srep08993
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Viable neuronopathic Gaucher disease model in medaka (Oryzias latipes) displays axonal accumulation of alpha-synuclein (2015)
  • Author(s): Uemura, N., Koike, M., Asai, K., Kinoshita, M., Fujiwara-Ishikawa, T., Matsui, H., Naruse, K., Sakamoto, N., Uchiyama, Y., Todo, T., Takeda S.I., Yamakado, H., Takahashi, R
  • Journal Title: Plos Genet. Volume: 11 Pages: e1005065
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005065
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cellular localization and tissue distribution of endogenous DFCP1 protein (2015)
  • Author(s): Nanao, T.*, Koike, M.*, Yamaguchi, J., Sasaki, M., Uchiyama, Y (*These authors contributed equally to this work)
  • Journal Title: Biomed. Res. Volume: 36 Pages: 121-33
  • DOI: 10.2220/biomedres.36.121
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] p150glued-associated disorders are caused by activation of intrinsic apoptotic pathway (2014)
  • Author(s): Ishikawa K., Saiki, S., Furuya, N., Yamada, D., Imaichi, Y., Li, Y., Kawajiri, S., Sasaki, H., Koike, M., Tsuboi, Y., Hattori N
  • Journal Title: Plos One Volume: 9 Pages: e94645
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0094645
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Pancreatic β cell failure mediated by mTORC1 hyperactivity and autophagic impairment (2014)
  • Author(s): Bartolome, A., Kimura-Koyanagi, M., Asahara, S., Guillen, C., Teruyama, K., Inoue, H., Shimizu, S., Kanno, A., García-Aguilar, A., Koike, M., Uchiyama, Y., Benito, M., Noda, T., Kido, Y
  • Journal Title: Diabetes Volume: 63 Pages: 2996-3008
  • DOI: 10.2337/db13-0970
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human IAPP-induced pancreatic beta-cell toxicity and its regulation by autophagy (2014)
  • Author(s): Shigihara, N.*, Fukunaka, A.*, Hara, A.*, Komiya, K., Honda, A., Uchida, T., Abe, H., Toyofuku, Y., Tamaki, M., Ogihara, T., Miyatsuka, T., Hiddinga, HJ, Sakagashira. S., Koike, M., Uchiyama, Y., Yoshimori, T., Eberhardt, NL, Fujitani, Y.*, Watada, H (*These authors contributed equally to this work)
  • Journal Title: J. Clin. Invest. Volume: 124 Pages: 3634-44
  • DOI: 10.1172/JCI69866
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nitric oxide-mediated injury of interstitial cells of Cajal and intestinal motility under endotoxemia of mice (2014)
  • Author(s): Ueshima S., Nishida, T., Koike, M., Matsuda, H., Sawa, Y., Uchiyama, Y
  • Journal Title: Biomed. Res. Volume: 35 Pages: 251-62
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Increased immunoreactivity of cathepsins in the rat esophagus under chronic acid reflux esophagitis (2014)
  • Author(s): Suyama, M.*, Koike, M.*, Asaoka, D., Mori, H., Oguro, M., Ueno, T., Nagahara, A., Watanabe, S. Uchiyama, Y (*These authors contributed equally to this work)
  • Journal Title: J. Histochem. Cytochem. Volume: 62 Pages: 645-60
  • DOI: 10.1369/0022155414542300
  • Peer Reviewed
• [Presentation] SEM連続断面観察法を活用した足細胞の立体構造解析 (2015)
  • Author(s): 市村浩一郎、宮崎直幸、完山正二、村田一義、小池正人、中村桂一郎、太田啓介、坂井建雄
  • Organizer: 日本顕微鏡学会「SEM連続断面観察による生物組織三次元再構築法研究部会」第三回研究会
  • Place of Presentation: 勝沼「ぶどうの丘」
  • Year and Date: 2015-03-25
• [Presentation] カテプシンD欠損およびAtg7欠損プルキンエ細胞の比較解析による軸索内環境の維持におけるオートファジー・リソソームタンパク質分解系の役割 (2015)
  • Author(s): 小池正人、内山安男
  • Organizer: 第120回日本解剖学会総会･全国学術集会・第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2015-03-23
  • Invited
• [Presentation] カテプシンD欠損マウスの神経細胞内に蓄積する異常なリソソームはp62およびNBR1を介した選択的オートファジーの標的となる (2015)
  • Author(s): 山口隼司、七尾友久、小池正人、小松雅明、内山安男
  • Organizer: 第120回日本解剖学会総会･全国学術集会・第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2015-03-23
• [Presentation] カテプシンD遺伝子欠損マウス脳におけるToll様受容体の機能解析 (2015)
  • Author(s): 砂堀毅彦、小池正人、内山安男
  • Organizer: 第120回日本解剖学会総会･全国学術集会・第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2015-03-23
• [Presentation] カテプシンD欠損神経細胞において、細胞極性がp62とNBR1を介した選択的オートファジーを制御する (2015)
  • Author(s): 七尾友久、山口隼司、小池正人、小松雅明、内山安男
  • Organizer: 第120回日本解剖学会総会･全国学術集会・第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2015-03-23
• [Presentation] 連続走査電顕断面観察法により解明された足細胞の新しい構造階層 (2015)
  • Author(s): 市村浩一郎、宮崎直幸、完山正二、村田一義、小池正人、中村桂一郎、太田啓介、坂井建雄
  • Organizer: 第120回日本解剖学会総会･全国学術集会・第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2015-03-22
• [Presentation] カテプシンD欠損脳における異常リソソーム蓄積タンパク質の探索 (2015)
  • Author(s): 曽高友深、内山安男、小池正人
  • Organizer: 第120回日本解剖学会総会･全国学術集会・第92回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2015-03-21
• [Presentation] 順天堂大学大学院医学研究科における形態学的研究の包括的な支援体制について (2015)
  • Author(s): 小池正人
  • Organizer: 第39回日本顕微鏡学会関東支部講演会
  • Place of Presentation: 工学院大学
  • Year and Date: 2015-02-28
• [Presentation] 連続走査電顕断面観察法により解明された足細胞の新しい構造階層 (2015)
  • Author(s): 市村浩一郎、宮崎直幸、完山正二、村田一義、小池正人、中村桂一郎、太田啓介、坂井建雄
  • Organizer: 第39回日本顕微鏡学会関東支部講演会
  • Place of Presentation: 工学院大学
  • Year and Date: 2015-02-28
• [Presentation] ゴルジ体局在型イオンチャネルGPHRの中枢神経系における役割 (2015)
  • Author(s): 曽高友深、小池正人
  • Organizer: 第20回グリアクラブ
  • Place of Presentation: KKR函館
  • Year and Date: 2015-01-28
• [Presentation] プルキンエ細胞特異的カテプシンD欠損およびAtg7欠損マウスの比較解析 (2015)
  • Author(s): 小池正人、砂掘毅彦、内山安男
  • Organizer: 第20回グリアクラブ
  • Place of Presentation: KKR函館
  • Year and Date: 2015-01-27
• [Presentation] オリゴデンドロサイト分化におけるmTORC1活性化の意義 (2015)
  • Author(s): 砂掘毅彦、小池正人
  • Organizer: 第20回グリアクラブ
  • Place of Presentation: KKR函館
  • Year and Date: 2015-01-27
• [Presentation] The role of autophagy and lysosomal proteolysis for the maintenance of the normal environment of neuronal cells: a genetic study of mouse models for rare neurodegenerative diseases for understanding of common ones (2014)
  • Author(s): Masato Koike
  • Organizer: INTERNATIONAL SYMPOSIUM 2014 (CURRENT TRENDS ON NEUROBIOLOGY)
  • Place of Presentation: Ulsan National Institute of Science and Technology
  • Year and Date: 2014-11-28
  • Invited
• [Presentation] ラット慢性逆流性食道炎モデルの食道重層上皮における 微細構造の変化についての検討 (2014)
  • Author(s): 小池正人 、森広樹 、後藤隆洋 、市村浩一郎 、浅岡大介 、永原章仁、上野隆、渡辺純夫、内山安男
  • Organizer: 日本解剖学会第１０２回関東支部学術集会
  • Place of Presentation: 東京医科大学病院
  • Year and Date: 2014-11-22
• [Presentation] Selective autophagy of lysosomes with ceroid-lipofuscin in neurons deficient in cathepsin D (2014)
  • Author(s): T. NANAO, M. KOIKE, J. YAMAGUCHI, C. WHITEHOUSE, T. ISHII, M. SHIBATA, Y. UCHIYAMA
  • Organizer: Society for Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: ワシントンDC
  • Year and Date: 2014-11-19
• [Presentation] L-carnitine enhances axonal plasticity and improves white matter lesions after chronic hypoperfusion in rat brain (2014)
  • Author(s): Y. UENO, M. KOIKE, Y. SHIMADA, H. SHIMURA, K. HIRA, Y. UCHIYAMA, N. HATTORI, T. URABE
  • Organizer: Society for Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: ワシントンDC
  • Year and Date: 2014-11-19
• [Presentation] Enrichment of GABARAP relative to LC3 in the axonal initial segments of neurons (2014)
  • Author(s): M. KOIKE, I. TANIDA, T. NANAO, N. TADA, J. IWATA, T. UENO, E. KOMINAMI, Y. UCHIYAMA
  • Organizer: Society for Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: ワシントンDC
  • Year and Date: 2014-11-18
• [Presentation] Hippocampal pyramidal neurons lacking LC3A and LC3B are resistant to hypoxic-ischemic brain injury in neonatal mice (2014)
  • Author(s): J. YAMAGUCHI, T. SUNABORI, M. KOIKE, T. NANAO, M. SHIBATA, A. FURUTA, Y. UCHIYAMA
  • Organizer: Society for Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: ワシントンDC
  • Year and Date: 2014-11-16
• [Presentation] ”Practical”ですが、何か? -医学部における電子顕微鏡- (2014)
  • Author(s): 小池正人
  • Organizer: 日本顕微鏡学会次世代顕微サイエンス若手研究部会 創設記念シンポジウム・若手討論会
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場
  • Year and Date: 2014-11-04
• [Presentation] Three-dimensional architecture of podocytes revealed by block-face scanning electron microscopy (2014)
  • Author(s): Ichimura K, Miyazaki N, Sadayama S, Murata K, Koike M, Nakamura K, Ohta K, Sakai T
  • Organizer: 日本顕微鏡学会次世代顕微サイエンス若手研究部会 創設記念シンポジウム・若手討論会
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場
  • Year and Date: 2014-11-03 – 2014-11-04
• [Presentation] ATP13A2やカテプシン異常と神経変性疾患 (2014)
  • Author(s): 小池正人
  • Organizer: 第55回神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2014-05-21
  • Invited
• [Presentation] 凍結超薄切片法の利用によるカテプシンD欠損マウス脳の解析 (2014)
  • Author(s): 小池正人、内山安男
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第70回記念学術講演会
  • Place of Presentation: 幕張メッセ
  • Year and Date: 2014-05-13
  • Invited
• [Book] Autophagy, Infection, and the Immune Response (2014)
  • Author(s): Tanida, I., Koike, M
  • Total Pages: 352
  • Publisher: John Wiley & Sons Inc.
• [Remarks]
  • URL: http://www.juntendo.ac.jp/graduate/laboratory/labo/shinkei_kozo/