ＦＧＦ‐Ｗｎｔシグナル経路を介したプラナリア有性化による配偶子産生制御機構の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Mechanisms regulating gamete formation in animals
• Project/Area Number: 26114501
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 小林 一也 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50360110)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 配偶子産生 / 分化多能性幹細胞 / 生殖様式 / FGF-Wntシグナル / プラナリア

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、未同定の有性化因子の刺激でプラナリア無性個体に雌雄同体性の生殖器官を誘導する有性化系を用いて、１．有性化を引き起こすWnt分子の同定、２．有性化制御因子の同定、３．FGF-Wntシグナル経路で働く有性化因子の同定を目指している。
１．有性化を引き起こすWnt分子の同定：実験動物プラナリアDugesia ryukyuensisのWnt遺伝子を９種クローニングした。これらのWnt遺伝子について有性化過程における発現解析を行い、生殖巣や生殖器官に発現しているWnt遺伝子を３種決定した。そのうちの１種は、無性個体に対してRNAi法による遺伝子ノックダウン（b-カテニン２遺伝子とのダブルノックダウン）で部分的な有性化を引き起こすことができた。
２．有性化制御因子の同定：RNA-seq解析により候補遺伝子を絞りこむ。RNA-seq解析のためのcDNAライブラリを作成した。
３．FGF-Wntシグナル経路で働く有性化因子の同定：プラナリアFGF関連遺伝子NDKがコードするタンパク受容体のコアゴニストとして働く有性化因子の存在を予想している。免疫沈降用のNDKリコンビナントを認識する抗体を作成した。一方で、有性化因子がプラナリア特有の生殖器官である卵黄腺に含まれているという発見から、卵黄腺に特異的あるいは多量に含まれている低分子化合物をメタボローム解析で約２０種同定した。これらの化合物の中から６種を無性個体に給餌したところ、４種に部分的有性化活性が認められた。これらは今後、NDKのコアゴニストとして働くか検証される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究項目１と３はおおむね順調に進んでいるが、研究項目２が遅れている。研究項目２はRNA-seq解析の分析を外部委託しているが、研究打ち合わせの段階で当初考えていた比較サンプル数では、目的を達成できない可能性があることがわかった。そのため、cDNAライブラリ作成に時間がかかっている状態であるため。

Strategy for Future Research Activity

１．有性化を引き起こすWnt分子の同定：候補遺伝子として絞り込んだ３種のWnt遺伝子とb-カテニン２遺伝子の４種の遺伝子ノックダウンのどの組み合わせで、無性個体に有性化を引き起こせるかを検証する。
２．有性化制御因子の同定：解析に必要なcDNAライブラリをすべて完成させて、RNA-seq解析により候補遺伝子を絞りこむ。候補遺伝子は遺伝子ノックダウンで有性化に関与するかを検証する。
３．FGF-Wntシグナル経路で働く有性化因子の同定：NDKリコンビナントと特異的に結合する化合物を有性化活性を持つ精製画分から昨年度作成した抗体を用いて免沈法で単離する。構造決定は質量分析やNMRで行う。メタボローム解析から得られた候補化合物に関してもNDKのコアゴニストとして働くか検証する。

Research Products

• [Journal Article] Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. (2014)
  • Author(s): Maezawa, T., Tanaka, H., Nakagawa, H., Ono, M., Aoki, M., Matsumoto, M., Ishida, T., Horiike, K., Kobayashi, K.
  • Journal Title: Mechanisms of Development Volume: 132 Pages: 69-78
  • DOI: doi:10.1016/j.mod.2013.12.003
  • Peer Reviewed
• [Presentation] プラナリアの生殖様式転換機構：有性化因子による無性生殖から有性生殖への誘導について (2014)
  • Author(s): 小林一也
  • Organizer: 第６０回日本寄生虫学会・日本衛生動物学会北日本支部合同大会
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2014-10-18
  • Invited
• [Presentation] プラナリア生殖器官特異的に発現するアミノ酸輸送体ホモログの解析 (2014)
  • Author(s): 石川正樹・前澤孝信・小林一也
  • Organizer: 日本動物学会第８５回仙台大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2014-09-13
• [Presentation] 新奇プラナリア卵黄タンパク質について (2014)
  • Author(s): 川瀬 摂・岩谷 尚・田中裕之・坂元君年・小林一也
  • Organizer: 日本動物学会第８５回仙台大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2014-09-13
• [Presentation] プラナリア生殖器官分化に注目したß-カテニン遺伝子の機能解析 (2014)
  • Author(s): 前澤孝信・菊池康哉・織井秀文・小林一也
  • Organizer: 日本動物学会第８５回仙台大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2014-09-11
• [Presentation] プラナリア生殖器官形成に注目したFGFR関連遺伝子の機能解析 (2014)
  • Author(s): 柳原由実・中川晴香・前澤孝信・梅園良彦・阿形清和・小林一也
  • Organizer: 日本動物学会第８５回仙台大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2014-09-11
• [Presentation] Tryptophan enhances the reproductive organs-specific expression level of an amino acid transporter homolog, Dr-slc38A9 in the sexual worms of Dugesia ryukyuensis. (2014)
  • Author(s): Ishikawa, M, Maezawa, T., Kobayashi, K.
  • Organizer: The 1st Asian PlanNet Meeting
  • Place of Presentation: Hong Kong
  • Year and Date: 2014-05-09