2014 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムワイド解析による複製開始複合体形成制御とクロマチン制御連携の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Functions of non-coding DNA region for genome integrity |
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| Project/Area Number |
26114713
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
藤田 雅俊 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (30270713)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 複製開始複合体 / クロマチン制御 / ゲノムワイド解析 / 次世代シークエンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒト細胞系において、①複製開始複合体（pre-RC）因子ORC1、CDC6、Cdt1及びMCM7、②それらと関連しているクロマチン制御因子、すなわち転写への関与も知られているSNF2Hおよび新規ヒストンシャペロンGRWD1、そして③ヒストンやその修飾、④クロマチン構造、などの時空間的連携を、非コード領域を含めゲノムワイドに解析する。本年度の解析で以下のことが明らかとなった。① HeLa細胞を用いCDC6、MCM7のChIP-Seqを行い、それらを組み合わせゲノムワイドにpre-RC形成部位を決定した。また、抽出されたMCM7結合部位は、既報告のSNS部位と有意に共局在した。同定されたpre-RC形成部位は、特定の配列に存在するというより、特定の領域に高密度で存在するものと考えられた。また、pre-RCは遺伝子のプロモーター部位に多く存在することがわかり、オープンなクロマチン構造を持った部位に形成されやすいことが考えられた。② 新規ヒストンシャぺロンGRWD1に対してもChIP-Seqを行い、pre-RCに有意に共局在していることを明らかにした。ここでは、抗GRWD1抗体を用いた内因性GRWD1に対する解析と、抗HA抗体を用いた外因性HA-GRWD1に対する解析を組み合わせることにより、より正確に結合部位を推定した。③ FAIRE-Seq解析により、SNSと共局在するpre-RC形成部位、つまり発火（複製開始）しやすいpre-RC形成部位は、オープンなクロマチン構造を持つことがわかった。そして、このpre-RC形成部位周辺のchromatin opennessの維持にGRWD1が重要な役割を持つことが示唆された。なおFAIRE法とは、細胞をホルムアルデヒド処理し、その後DNAを断片化、フェーノール抽出を行うことで蛋白質結合の多いDNA断片とフリーのDNA断片を分離し、可溶性画分DNA断片を解析する方法のことである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全体的に、概ね順調に進んでいると考えている。上述のように興味深い結果を得ており、本年度のデータと併せ早期の論文発表を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
以上の結果を踏まえ平成27年度は以下の検討を行う。
① Seqの結果を、代表的な複製開始点におけるqPCR解析によって確認する。LMNB2及びMCM4 originにおいて、概ね予想通りの結果を得つつある。
② 更に、Seqの結果から、いくつかの新たなGRWD1に制御されていると思われる新規originを選び、その妥当性をqPCRで検討する。
③ 新たにSNF2HのChIP-Seq解析を開始する。そしてSNF2H抑制のpre-RC形成部位周辺のクロマチン状態への影響を調べる。すなわち、SNF2HをsiRNAで抑制して、FAIRE-Seq解析等を行う。
④ 以上のデータに関して、すでに登録されているヒストン修飾や他の転写因子のChIP-Seqデータとも比較しつつバイオインフォマティクス解析を行う。
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