細胞集団中のマイノリティのジェノタイプを一細胞レベルで同定する方法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Spying minority in biological phenomena -Toward bridging dynamics between individual and ensemble processes-
• Project/Area Number: 26115719
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 城口 克之 独立行政法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (00454059)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: １細胞解析 / シークエンサ / ハイスループット

Outline of Annual Research Achievements

１細胞の分解能を維持するためには、それぞれの細胞を空間的に分ける必要がある。そこで、細胞の濃度を適度に薄めて、ドロプレットに封入した。顕微鏡で確認したところ、数割のドロプレットに細胞が封入されていることが確認できた。
次のステップは、ドロプレット内でのゲノム配列（ターゲット部位）の増幅である。数百塩基対の配列のＰＣＲ増幅を試みたが簡単には増幅シグナルが得られなかったため、複数のプライマーを設計し、まずは通常のチューブ内のＰＣＲ反応で、１細胞からゲノム配列を増幅できるかを検討した。チューブ内で特異的に増幅できたプライマーを用い、さらに、様々なＰＣＲ条件を試し、ようやくドロプレット内の細胞からの増幅シグナルが得られた。増幅の検出には、増幅に依存して強度がます蛍光プローブを用いた。非特異的な増幅でないことを確認するため、ゲル電気泳動で増幅産物を確認したところ、長さが確かに設計と一致した。これにより、ドロプレット内の１細胞から、ゲノムＤＮＡの一部を増幅できることが確認された。
次に、各ドロプレットの増幅産物に、それぞれ異なるバーコード配列を結合することを試みた。様々な条件を試した結果、この結合は、プライマーの絶対濃度や相対濃度に大きく依存することが分かった。さらには、PCRのサイクル数や、温度条件にも、意外なかたちで依存した。最適な条件を検討したところ、増幅産物にバーコード配列が結合したことがゲル電気泳動の長さ解析から確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ドロプレット内でのＰＣＲ反応や、増幅産物にバーコード配列を結合するところなどが、予期しない条件に依存するなど、解決に時間がかかる面もあった。しかし、丁寧に条件を検討することで乗り越え、全体としては、順調に研究が推進していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、複数のターゲット部位を同時に増幅し、それらの増幅産物すべてにバーコード配列を結合できるようにする。さらに、たくさんの細胞を解析できるようにハイスループット化するため、たくさんのドロプレットを作製できるようにする。たくさんの細胞を解析できるようになったら、次世代シークエンサで配列を解析し、レアな細胞が同定できるかを検証する。