2014 Fiscal Year Annual Research Report
基部陸上植物の葉緑体型ペプチドグリカン結合性タンパク質の単離と解析
Publicly Offered Research
| Project Area | "Matryoshka"-type evolution of eukaryotes |
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| Project/Area Number |
26117720
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
高野 博嘉 熊本大学, 自然科学研究科, 教授 (70242104)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 植物 / 形態 / 葉緑体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
葉緑体は、シアノバクテリア（藍藻）の原始真核細胞への共生により生じた。藍藻の持つペプチドグリカン（ＰＧ）は進化の過程で葉緑体から消失したと考えられて来たが、我々はＰＧ合成系遺伝子をコケ植物が持つこと、これらの遺伝子を破壊すると葉緑体分裂異常が生じることを見出した。これらのことは、細菌から持ち込まれたＰＧ関連遺伝子が現在でもコケ植物の葉緑体において分裂等の基本的な葉緑体機能にかかわっていることを示唆している。
２０１４年２月、ＰＧの構成要素であるＤ-アラニル-Ｄ-アラニンをプローブに用いた実験系により、今までＰＧが見いだされていなかったクラミジアでＰＧが初めて見いだされた。これは、エチニル基を付加したＤ-アラニル-Ｄ-アラニンをＰＧに取り込ませた後、エチニル基に蛍光物質をクリック反応で結合させる方法である。この方法をヒメツリガネゴケに応用すればＰＧの存在を確かめられるのではないかと考え、同様の方法で観察したところ、通常の電子顕微鏡観察では観察できない葉緑体型ＰＧの可視化に成功した。これは緑色植物の葉緑体における最初の葉緑体局在型ＰＧの観察例である。その結果、ヒメツリガネゴケでは葉緑体の周り全てにＰＧ層が存在していることを明らかにすることができた。
また、ヒメツリガネゴケ葉緑体型ＰＧ結合性タンパク質の単離に関しては、ペニシリン結合タンパク質ＰＢＰと協調して働く葉緑体型ＰＧ結合性タンパク質の単離に向けて、タグを付加したＰＢＰを発現する形質転換ラインの作成や、ＰＧ結合ドメインであるＳ-ｌａｙｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ （ＳＬＨ） ｄｏｍａｉｎを持つタンパク質（ＳＬＨタンパク質）の遺伝子破壊ラインの作成等の解析を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
結合性タンパク質の単離には未だ至っておらず、その点に関しては少々の遅れが見られるが、本年度についてはコケ植物でｉｎｖｉｓｉｂｌｅ ｗａｌｌであったＰＧの存在をクリック反応を応用した実験系で明らかにできており、十分な成果を得ることができたと考えている。２７年度についても、柱の１つとしてこの実験系を更に進めていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）葉緑体型ＰＧの可視化による解析
我々は昨年度ヒメツリガネゴケでは葉緑体の周り全てにＰＧ層が存在していることを明らかにした。本年度は、この方法を用いた解析を進めたい。まずは葉緑体型ＰＧが存在すると予想される灰色植物や車軸藻類を用いて同様の方法で葉緑体型ＰＧの存在様式を明らかにしたい。緑藻類やシロイヌナズナには葉緑体型ＰＧが存在しないと予測できるため、これらを用いたネガティブコントロールについても実験を進める。
（２） ヒメツリガネゴケ葉緑体型ＰＧ結合性タンパク質の単離と解析
大腸菌ではＰＢＰは複合体を作って機能しているため、ヒメツリガネゴケ葉緑体型ＰＢＰと協調して働くタンパク質を同定できれば、新規のＰＧ結合性タンパク質を同定できる可能性がある。ヒメツリガネゴケＰＢＰ抗体では結合するタンパク質の単離が難しかったため、タグを付加したＰＢＰを発現する形質転換ラインをヒメツリガネゴケで作成した。27年度はこれを完成させ、タグに対する抗体で免疫沈降等を行うことによりＰＢＰと複合体を作るタンパク質を同定し、質量分析法により同定していきたい。
また、ＰＧ-外膜接着システムであるＳ-ｌａｙｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＳＬＨ）ｄｏｍａｉｎを持つタンパク質（ＳＬＨタンパク質）を用いた解析も進める。ヒメツリガネゴケゲノムには相同性は低いもののＳＬＨタンパク質が４つ存在していた。それぞれ2つの遺伝子を持つ2タイプにわかれるため、27年度には二重破壊ラインを完成させ、その葉緑体を調べることで形質変異を調べて行きたい。これの相同遺伝子はシロイヌナズナにも３つ存在しており、遺伝子破壊ラインの作成を進めていく予定である。
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[Journal Article] Bending of protonema cells in a plastid glycolate/glycerate transporter knockout line of Physcomitrella patens.2015
Author(s)
Nakahara, J., Takechi, K., Myouga, F., Moriyama, Y., Sato, H., Takio, S. and Takano, H.
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Journal Title
PLos One
Volume: 10
Pages: e0118804
DOI
Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] D-alanyl-D-alanine is required for moss plastid division, but not for Arabidopsis2014
Author(s)
Takayuki Hirano, Koji Tanidokoro, Yasuhiro Shimizu, Yutaka Kawarabayasi, Toshihisa Ohshima, Momo Sato, Shinji Tadano, Hayato Ishikawa, Susumu Takio, Katsuaki Takechi, Hiroyoshi Takano
Organizer
2nd International Sympodium for Integrated Science for Molecular Chirality in Biology and Chemistry
Place of Presentation
熊本県阿蘇郡ホテルグリーンピア南阿蘇
Year and Date
2014-11-30 – 2014-12-01
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