2015 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類細胞での合成生物学を志向した次々世代型ジェネティックエンジニアリング技術
Publicly Offered Research
| Project Area | Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks |
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| Project/Area Number |
26119703
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
野村 渉 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (80463909)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質 / DNA / ゲノム編集 / CRISPR-Cas / テロメア / hTERT |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では哺乳類細胞のゲノムに特化した技術、任意の標的配列を編集もしくは改変できる技術としてヌクレアーゼによるゲノム編集技術であるZFN、TALEN、CRISPR-Cas9システムの3技術の各特長を組み合わせ、合成生物学研究に利用できる基盤技術としての体系化を推進した。その成果として、ラパマイシンにより会合が誘導されるFKBP-FRBドメインを利用したDNA切断系の構築と転写制御システムへの応用が挙げられる。ZF、TALEドメインにFKBPを融合し、FokIドメインにFRBを融合させたタンパク質を構築した。ZFN、TALENでは標的配列上でFokIドメインが二量体形成してDNA切断が誘導される。DNA結合ドメインとFokIドメインをつなぐリンカー部分にFKBP、FRBを導入し、ラパマイシン添加によって二量体形成が再現される仕組みとした。各ドメインをin vitro translationで得て、in vitroでの標的DNA切断実験を行った。その結果、ZFNとTALE-FKBP/FRB-FokIの組み合わせで切断が確認された。リンカー部分にFKBP-FRB会合ドメインを利用しているため、標的配列の最適化によってより高い切断効率が得られると予測されるため今後の課題としている。ラパマイシンによる転写活性制御においてはTALEドメイン／dCas9を基にIL-1RNプロモーター領域に結合するDNA結合タンパク質を作製し、ラパマイシン存在下において、転写活性化または抑制ドメインと会合して転写活性制御ができる仕組みを構築した。哺乳類細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイによってラパマイシン添加の有無によって遺伝子発現調節のon/offが可能であり、プロモーター領域の複数箇所を標的とすることで各人工転写因子の協奏的な効果が得られた。また、内因性遺伝子プロモーターにも適用可能であった。
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| Research Progress Status |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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