無細胞系ナノ構造化生物機能システムの開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks
• Project/Area Number: 26119707
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 中野 秀雄 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 酵素 / 無細胞タンパク質合成系 / エマルジョン / ナノストラクチャー

Outline of Annual Research Achievements

研究では、転写および酵素反応を定量的に解析、スクリーニングする新規な実験系を確立することを目的とした。それにより従来にない膨大なライプラリーの作製と短時間でのスクリーニングを可能とし、合成生物学 における重要な分子パーツである、酵素やDNA ポリメラーゼープロモーターの新規セットを探索し、有用酵素創出の基盤技術をつくり上げることを目標としている。以下に今年度の成果を列挙する。
１）酵母由来Dアミノ酸オキシダーゼ(DAO) を、活性ある形での無細胞タンパク質合成系を確立し、さらにDNA結合タンパク質との融合タンパク質として合成させ、マイクロビーズ上でのHRPとの連続反応により、酵素活性をハイスループットに測定させる系を構築した。２）結合するDNA配列が異なるscCro変異体を複数作製し、それらの結合DNAに対する親和性を測定した。３）トランスグルタミナーゼをDNA結合タンパク質scCro との融合タンパク質として無細胞タンパク質合成系で発現させ、活性体として発現させることに成功した。４）HRPの無細胞タンパク質合成系により活性体として発現に成功し、それをマイクロビーズ上に提示させ、酵素活性を指標としたセルソーターを用 いたハイスループットスクリーニング方法を確立した。 ５）RNAポリメラーゼ－プロモーター配列の無細胞タンパク質合成系を用いたクリーニングシステムの構築した。
以上の研究成果は、合成生物学的アプローチに欠かせない新規タンパク質・転写プロモーターの開発に大きく寄与するものである。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Texas/North Western University(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: University of Texas/North Western University
• [Journal Article] Immobilization of proteins onto microbeads using a DNA binding tag for enzymatic assays (2016)
  • Author(s): Kojima, T., Mizoguchi, T., Ota, E., Hata, J., Homma, K., Zhu, B., Hitomi, K., and Nakano, H.
  • Journal Title: J. Biosci. Bioeng. Volume: 121 (2) Pages: 147-153
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2015.06.003.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Handmade microfluidic device for biochemical applications in emulsion. (2016)
  • Author(s): Murzabaev M, Kojima T, Mizoguchi T, Kobayashi I, DeKosky BJ, Georgiou G, Nakano H1
  • Journal Title: J Biosci Bioeng. Volume: 121 Pages: 471-476
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2015.08.001.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ultra-High-Throughput Screening of an In Vitro-Synthesized Horseradish Peroxidase Displayed on Microbeads Using Cell Sorter (2015)
  • Author(s): Zhu, B., Mizoguchi, T., Kojima, T., and Nakano, H.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0127479
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0127479. eCollection 2015.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Construction of a DNA library on microbeads using whole genome amplification. (2015)
  • Author(s): Kojima, T., Zhu, B., and Nakano, H.
  • Journal Title: Methods Mol Biol. Volume: 1347 Pages: 87-100
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2990-0_6.
  • Acknowledgement Compliant
• [Presentation] DNA結合タンパク質タグを利用した酵素の整列化技術とビーズディスプレイへの応用。 (2016)
  • Author(s): 林 健太, 太田 英里, 朱 博, 兒島 孝明, 中野 秀雄.
  • Organizer: 日本農芸化学会2016年大会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2016-03-27 – 2016-03-30
• [Presentation] In vitro maturation of soluble manganese peroxidase expressed in chaperone over-expressing E. coli. (2016)
  • Author(s): Almasul Alfi, Bo Zhu, Jasmina Damnjanovic, Takaaki Kojima, Yugo Iwasaki, Hideo Nakano.
  • Organizer: 日本農芸化学会2016年大会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2016-03-27 – 2016-03-27
• [Presentation] Expression of soluble manganese peroxidase in chaperons over-expressing E. coli and in vitro maturation by ATP-dependent chaperons releasing. (2015)
  • Author(s): Alfi Almasul, Bo Zhu, Jasmina Damnjanovic, Takaaki Kojima, Yugo Iwasaki, Hideo Nakano.
  • Organizer: 日本生物工学会２０１５年度大会
  • Place of Presentation: 鹿児島
  • Year and Date: 2015-10-26 – 2015-10-28
• [Presentation] マウス TG2 の無細胞蛋白質合成系での発現。 (2015)
  • Author(s): 秦 純平, 溝口 琢朗, 兒島 孝明, 人見 清隆, 中野 秀雄.
  • Organizer: 日本生物工学会２０１５年度大会
  • Place of Presentation: 鹿児島
  • Year and Date: 2015-10-26 – 2015-10-28