Biosynthetic redesign of small molecules aimed for the concurrent improvements of cell permeability and water solubility

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 16H06445
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Fukui Prefectural University
• Principal Investigator: 濱野 吉十 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50372834)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸山 千登勢 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (20452120) ; 山中 一也 関西大学, 化学生命工学部, 准教授 (30756870)
• Project Period (FY): 2016-06-30 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥72,020,000 (Direct Cost: ¥55,400,000、Indirect Cost: ¥16,620,000); Fiscal Year 2020: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2019: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2018: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2017: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2016: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000)
• Keywords: ポリカチオン / 細胞膜透過性 / 生体膜 / 応用微生物 / 有機化学 / 生理活性 / 生体膜透過性 / アミノ酸ポリマー

Outline of Annual Research Achievements

ポリカチオン性化合物は、高極性でありながら高い生体膜透過性も併せ持つことが知られている。そこで本研究では、「①生体膜透過性・水溶性に問題がある既存薬物」、「②微生物未利用遺伝子から創出する新規機能性低分子」の2種の低分子化合物について、ポリカチオン化修飾による生体膜透過性と水溶性の一挙改善を目指す。本研究の目的達成のために、研究項目Aとして「ポリリジン不飽和アルコールエステルによる機能性低分子のポリカチオン化修飾」、研究項目Bとして「微生物ゲノムマイニングによる新規ポリカチオン化合物の探索および新規機能性低分子の創製」、研究項目Cとして「ポリカチオン化機能低分子の細胞膜透過性および機能発現評価」、計3つの研究項目を計画した。
平成28年度は、クリック官能基化ポリαリジンとしてε-PL-PEG4-アジドを用い、蛍光色素（FAM）のポリカチオン修飾法を確立した（研究項目A）。さらに、ポリカチオン修飾したFAMの細胞膜透過性に必須である動物細胞培養の実験系を立ち上げた（研究項目C）。HeLa細胞にて、ポリカチオン修飾したFAMの細胞膜透過性について評価したところ、期待度折り高い生体膜透過性を観察し、さらに、水難溶性のFAMを水溶性に変換できたことから、ポリカチオン修飾による生体膜透過性と水溶性の一挙改善が可能であることを示した（研究項目C）。ポリカチオン修飾する機能性低分子としては、既存薬物以外に、微生物未利用遺伝子から創出する新規機能性低分子をターゲットにしている。そこで、本研究に必須な技術であるin vivoクローニングを基盤とした異種発現システムの構築を行った（研究項目B）。さらに、物理化学的な生体膜透過性の評価法を確立するために、電気分析法の検証を開始した（研究項目C）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

【研究項目A：ポリリジン不飽和アルコールエステルによる機能性低分子のポリカチオン化修飾】クリック官能基化ポリαリジンとしてε-PL-PEG4-アジドを用い蛍光色素（FAM）のポリカチオン修飾法を確立した。さらに、ポリカチオン修飾したFAMの細胞膜透過性評価に必須である動物細胞培養（HeLa細胞）の実験系を立ち上げ評価したところ、期待度折り高い生体膜透過性を観察した。さらに、ポリカチオン修飾することで水難溶性のFAMを水溶性に変換できたことから、ポリカチオン修飾による生体膜透過性と水溶性の一挙改善が可能であることを実験的に証明した。
【研究項目B：微生物ゲノムマイニングによる新規ポリカチオン化合物の探索および新規機能性低分子の創製】ポリカチオン修飾する機能性低分子として、既存薬物以外に、微生物未利用遺伝子から創出する新規機能性低分子もターゲットにしている。そこで、本研究に必須な技術であるin vivoクローニングを基盤とした異種発現システムを研究分担者である山中一也　准教授（関西大学）との共同研究で構築した。さらに、「ポリαリジン」や「ポリβリジン」以外の天然ポリカチオン化合物を微生物から探索し、ポリカチオン修飾ツールの拡充を図るために、海洋および土壌由来の微生物から新規ポリカチオン化合物の探索を行った。現在、土壌由来の放線菌において新規ペプチド鎖長を有するε-PLの生産を確認している。
【研究項目C：ポリカチオン化機能低分子の細胞膜透過性および機能発現評価】
ポリカチオン修飾した蛍光色素（FAM）の細胞膜透過性について、現在、HeLa細胞を用いた評価系を確立しているが、より物理化学的な生体膜透過性評価を目的に電気分析法を検証中である。
以上、研究項目全体としては、当初の計画通りに進展している。

Strategy for Future Research Activity

【研究項目A：ポリリジン不飽和アルコールエステルによる機能性低分子のポリカチオン化修飾】クリック官能基化ポリαリジンとしてε-PL-PEG4-アジドを用いた蛍光色素（FAM）のポリカチオン修飾法を確立している。そこで、本技術を発展させ、既存薬物のポリカチオン修飾を実施し、薬物の水難溶性と生体膜透過性の一挙改善を目指す。アムフォテリシンB（AmpB）は、臨床上重要な抗真菌抗生物質であり、生体膜透過性に乏しい超水難溶性化合物の代表例と言える。そこで、AmpBを薬物モデルとしてポリカチオン修飾による生体膜透過性と水難溶性の一挙改善をH29年度内に達成する。
【研究項目B：微生物ゲノムマイニングによる新規ポリカチオン化合物の探索および新規機能性低分子の創製】微生物未利用遺伝子から新規機能性低分子を創出するための異種発現システムは構築済みである。そこで、ポリカチオン修飾するターゲット化合物の拡充を目指し、種々化合物の創出を行う。また、本技術を利用して、「ポリαリジン」や「ポリβリジン」以外の天然ポリカチオン化合物を創製し、ポリカチオン修飾ツールの拡充も図る。
【研究項目C：ポリカチオン化機能低分子の細胞膜透過性および機能発現評価】引き続き、連携研究者である片野　肇　教授（福井県立大学）との共同研究にて、ポリカチオン修飾化合物のより物理化学的な生体膜透過性評価を目的に電気分析法を検討する。