Engineered biosynthesis of new natural products for innovative drug discovery

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 16H06449
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 渡辺 賢二 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (50360938)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 植木 尚子 岡山大学, 資源植物科学研究所, 准教授 (50622023)
• Project Period (FY): 2016-06-30 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥72,020,000 (Direct Cost: ¥55,400,000、Indirect Cost: ¥16,620,000); Fiscal Year 2020: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2019: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2018: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2017: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2016: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000)
• Keywords: 生合成 / リデザイン / 天然物 / 担子菌 / 抗生物質 / 生合成リデザイン / テルペノイド / 天然物化学 / キノコ / 酵素 / 遺伝子 / 微量天然物 / 異種発現 / 生合 / 反応機構 / 糸状菌 / Aspoquinolone / ゲノム情報 / 物質生産

Outline of Annual Research Achievements

担子菌ウシグソヒトヨタケCoprinopsis cinereaにおける内因性遺伝子の強制発現
C. cinereaを宿主とした異種遺伝子発現を行う準備段階として、まずはC. cinerea自身の遺伝子を強制発現させることを試みた。既に我々は本遺伝子についてcDNAを取得した後にクローニングし、出芽酵母を用いて異種発現させることでその産物がオルセリン酸 (1)であることを報告している。そこでCC1G_05377の上流に強制発現が可能と考えられるb-tublin、EF3、DED19の各プロモーターを配置したプラスミドを構築し、これをC. cinerea 326株に導入した。PCRによって遺伝子導入が確認された変異体をMYG培地にて振盪培養し、その代謝産物をLC-MSにて解析したところ、それぞれ最大で約10倍(pb-tublin)、約100倍(pEF3)、約250倍(pDED1)と野生株よりも生産性の向上したクローンを得ることに成功した。
続いてcop6遺伝子(CC1G_03563)に着目した。本遺伝子はセスキテルペン合成酵素Cop6をコードしており、FPPよりa-cupreneneを生合成することが報告されている。C. cinerea由来のa-cuprenene関連化合物としてはlagopodin類が知られており、加えてlagopodin類がさらに代謝されて生成したと考えられるhytoyol類の構造がつい最近、報告された。しかし、lagopodinおよびhytoyol生合成におけるcop6遺伝子の関与について直接的な証拠はこれまでに得られていなかった。そこでcop6遺伝子についてDED1プロモーターによる強制発現を試みた。得られた形質転換体は、野生株と比較してlagopodin類が約2-3倍、hytoyol類の生産性が約15倍に増加したクローンを見出すことに成功した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

Lagopodin類の生合成経路に関して、α-cupreneneが順次酸化されることで生合成されると予想されているものの、これまでに実験的に証明はされていない。そこで、本研究ではlagopodin類の生合成経路の解明を目指した。
研究対象として、lagopodin類を生産し、遺伝子の操作系も確立されているC. cinereaを用いた。C. cinereaのゲノム情報を参照すると、テルペン環化酵素をコードするcop6に隣接して酸化酵素であるシトクロムP450をコードする遺伝子が２つ（cox1、cox2）存在していることが確認された。そこで、本研究ではcop6、cox1およびcox2遺伝子を出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeで異種種宿主発現することや、C. cinereaのこれら遺伝子を破壊することで、lagopodin類の生合成経路について解析した。S. cerevisiaeを宿主としてcop6等を発現させるためのベクターを作製し、形質転換した後、それらの生産物を確認したところ、cop6導入株ではα-cupreneneの生産が観測された。さらに、cop6、cox1およびcox2の共発現株では2の生産が確認されたものの、lagopodin類の産生は確認されなかった。
続いて、C. cinereaのcop6遺伝子等の破壊株を用いてlagopodin類が生産されるか調べたところ、cop6破壊株ではlagopodinの生産は確認されなくなったものの、cox1やcox2破壊株ではlagopodin類の生産は依然として観測された。そのため、α-cupreneneや2をlagopodin類へと酸化する酵素がcox1およびcox2以外にもC. cinereaにコードされていることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

今回の研究成果によって、キノコを用いリード化合物の探索および大量生産という２大課題を同時に達成できる高い技術に手が届いたと言えるであろう。キノコ類に関しては、単離されてきた天然物の化学構造を眺めてみると糸状菌由来天然物と類似した分子も見受けられるが、その生合成起源および生合成経路が不明瞭な分子も少なくない。このような分子は糸状菌とは異なる生合成遺伝子・酵素から生合成されていると予想できる。本法論を用いて未開拓のキノコを調査することで数多くの新規成分の発見が期待できる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of California Los Angeles(米国)
• [Int'l Joint Research] Leibniz Institute(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] カリフォルニア大ロサンゼルス校(米国)
• [Int'l Joint Research] University of California, Los Angeles(USA)
• [Int'l Joint Research]
• [Journal Article] Biosynthesis of lagopodins in mushroom involves a complex network of oxidation reactions. (2019)
  • Author(s): Masuya Takahiro、Tsunematsu Yuta、Hirayama Yuichiro、Sato Michio、Noguchi Hiroshi、Nakazawa Takehito、Watanabe Kenji
  • Journal Title: Organic and Biomolecular Chemistry Volume: 17 Pages: 234-239
  • DOI: 10.1039/c8ob02814a
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enzymatic one-step ring contraction for quinolone biosynthesis (2018)
  • Author(s): Kishimoto Shinji、Hara Kodai、Hashimoto Hiroshi、Hirayama Yuichiro、Champagne Pier Alexandre、Houk Kendall N.、Tang Yi、Watanabe Kenji
  • Journal Title: Nature Commun Volume: 9 Pages: 1-1
  • DOI: 10.1038/s41467-018-05221-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Genome Mining and Assembly-Line Biosynthesis of the UCS1025A Pyrrolizidinone Family of Fungal Alkaloids (2018)
  • Author(s): Li Li、Tang Man-Cheng、Tang Shoubin、Gao Shushan、Soliman Sameh、Hang Leibniz、Xu Wei、Ye Tao、Watanabe Kenji、Tang Yi
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 140 Pages: 2067-2071
  • DOI: 10.1021/jacs.8b00056
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Enzymatic Amide Tailoring Promotes Retro-Aldol Amino Acid Conversion To Form the Antifungal Agent Aspirochlorine (2018)
  • Author(s): Tsunematsu Yuta、Maeda Naoya、Yokoyama Mamoru、Chankhamjon Pranatchareeya、Watanabe Kenji、Scherlach Kirstin、Hertweck Christian
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 57 Pages: 14051-14054
  • DOI: 10.1002/anie.201806740
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase hybrid enzymes of fungi (2018)
  • Author(s): Kishimoto, S., Hirayama, Y., Watanabe, K.
  • Journal Title: The Mycota XV: Physiology and Genetics Volume: 368 Pages: 1-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Integration of Chemical, Genetic, and Bioinformatic Approaches Delineates Fungal Polyketide-Peptide Hybrid Biosynthesis (2017)
  • Author(s): Yokoyama M, Hirayama Y, Yamamoto T, Kishimoto S, Tsunematsu Y, Watanabe K
  • Journal Title: Org Lett Volume: 19 Pages: 2002-2005
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SAM-dependent enzyme-catalysed pericyclic reactions in natural product biosynthesis (2017)
  • Author(s): 1.Ohashi, M., Liu, F., Hai, Y., Chen, M., Tang, M.-C., Yang, Z., Sato, M., Watanabe, K., Houk, K. N., Tang, Y.
  • Journal Title: Nature Volume: 549 Pages: 502-506
  • DOI: 10.1038/nature23882
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Oxidative Cyclization in Natural Product Biosynthesis (2017)
  • Author(s): Tang Man-Cheng、Zou Yi、Watanabe Kenji、Walsh Christopher T.、Tang Yi
  • Journal Title: Chemical Reviews Volume: 117 Pages: 5226-5333
  • DOI: 10.1021/acs.chemrev.6b00478
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Elucidation of Biosynthetic Pathways of Natural Products (2017)
  • Author(s): Kishimoto, S., Tsunematsu, Y., Sato, M., Watanabe, K.
  • Journal Title: The Chemical Record Volume: 印刷中 Pages: 1095-1108
  • DOI: 10.1002/tcr.201700015
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Integration of chemical, genetic and bioinformatic approaches delineates fungal polyketide-peptide hybrid biosynthesis. (2017)
  • Author(s): Yokoyama, M., Hirayama, Y., Yamamoto, T., Kishimoto, S., Tsunematsu, Y., Watanabe, K.
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.7b00559
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Biochemical characterization of an eukaryotic decalin-forming Diels-Alderase. (2016)
  • Author(s): Li, L., Yu, P., Tang, M. C., Zou, Y., Gao, S.-S., Hung, Y.-S., Zhao, M., Watanabe, K., Houk, K., Tang, Y.
  • Journal Title: J. Am. Chem. Soc. Volume: 138 Pages: 15837-15840
  • DOI: 10.1021/jacs.6b10452
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Regioselective dichlorination of a non-activated aliphatic carbon and phenol bismethylation by a multifunctional fungal flavoenzyme. (2016)
  • Author(s): Chankhamjon, P., Tsunematsu, Y., Ishida-Ito, M., Sasa, Y., Meyer, F., Boettger-Schmidt, D., Urbansky, B., Menzel, K. D., Scherlach, K., Watanabe, K., Hertweck, C.
  • Journal Title: Angew. Chem. Int. Ed. Volume: 55 Pages: 11955-11959
  • DOI: 10.1002/anie.201604516
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] OxidativetranstocisIsomerization of Olefins in Polyketide Biosynthesis (2016)
  • Author(s): Tsuyoshi Yamamoto, Yuta Tsunematsu, Kodai Hara, Tomohiro Suzuki, Shinji Kishimoto, Hirokazu Kawaguchi, Hiroshi Noguchi, Hiroshi Hashimoto, Yi Tang, Kinya Hotta, & Kenji Watanabe
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 印刷中 Pages: 6207-6210
  • DOI: 10.1002/anie.201600940
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Simple Screening for High-Colibactin Producers from Clinical Samples Using Activity- Based Fluorescent Probe (2018)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: U.S.-Japan Cooperative Medical Sciences Program (USJCMSP)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ENZYMATIC ONE-STEP RING CONTRACTION FOR QUINOLONE BIOSYNTHESIS (2018)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: 2nd China-Japan Joint Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Simple Screening for High-Colibactin Producers from Clinical Samples Using Activity- Based Fluorescent Probe (2018)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: 30th International Symposium on the Chemistry of Natural Products
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Simple Screening for High-Colibactin Producers from Clinical Samples Using Activity- Based Fluorescent Probe (2018)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: 6th Biennial International Conference on New Developments in Drug Discovery from Natural Products and Traditional Medicines
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Crystallographic characterization of a [4+2]-cyclase binding site and mutational alteration of stereoselectivity (2018)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: The 2nd International Symposium on Organic Reaction Mechanism
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Genetic indoctrination of Escherichia coli for finding genotoxins “colibactin” facilitating inflammation-induced colorectal cancer (2017)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: US-Japan Cooperative Medical Sciences Program, 19th International Conference on Emerging Infectious Diseases in the Pacific Rim
  • Place of Presentation: Seoul, South Korea
  • Year and Date: 2017-02-07
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Disfavored exo-adduct formation by a modified octalin-forming Diels-Alderase (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Organizer: China/Japan Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Disfavored exo-adduct generation by a modified octalin-forming Diels-Alderase (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Organizer: Society for Industrial Microbiology
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Pseurotin biosynthesis in fungus (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Organizer: 9th US-Japan Seminar: The international Conference of Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Novel Genotoxins “Colibactin” Produced by E.coli and colon carcinogenesis (In Vitro, In Vivo Experiments) (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Organizer: The 12th international conference and 5th Asian congress on environmental mutagens with the 33rd annual meeting of KSOT/KEMS
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Genetic indoctrination of Escherichia coli for finding genotoxins colibactin facilitating inflammation-induced colorectal cancer (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Organizer: US-Japan Cooperative Medical Sciences Program Cancer Panel Meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 実用的物質生産系構築にむけたゲノム情報に基づく 新規生合成システムのリデザイ (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Organizer: 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成化学（新学術領域）第一回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学, 東京
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Oxidative trans-to-cis isomerization of olefin in polyketide biosynthesis (2016)
  • Author(s): Kenji Watanabe
  • Organizer: The 13th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms
  • Place of Presentation: Wuhan, People’s Republic of China
  • Year and Date: 2016-10-16
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] 天然物の化学Ⅱ（科学のとびら64) (2018)
  • Author(s): 上村大輔, 渡辺賢二
  • Total Pages: 192
  • Publisher: 東京化学同人
  • ISBN: 9784807915057
• [Book] 天然物生合成におけるS-アデノシルメチオニン依存性酵素により触媒されるペリ環状反応 (2018)
  • Author(s): 大橋雅生, 渡辺賢二
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 現代化学
• [Book] Polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase hybrid enzymes of fungi. The Mycota XV: Physiology and Genetics (2018)
  • Author(s): Kishimoto, S., Hirayama, Y., Watanabe, K.
  • Total Pages: 7
  • Publisher: Springer
• [Book] 現代化学 (2017)
  • Author(s): 大橋雅生, 渡辺賢二
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 東京化学同人
• [Book] BIO Clinica (2017)
  • Author(s): 渡辺賢二
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 北隆館／ニュー・サイエンス社
• [Remarks] 渡辺賢二 研究室
  • URL: http://sweb.u-shizuoka-ken.ac.jp/~kenji55-lab/
• [Remarks] 研究内容
  • URL: http://sweb.u-shizuoka-ken.ac.jp/~kenji55-lab/
• [Remarks] WATANABE RESEARCH GROUP
  • URL: http://sweb.u-shizuoka-ken.ac.jp/~kenji55-lab/
• [Patent(Industrial Property Rights)] コリバクチン産生菌検出用プライマーセット及び検出用キット (2019)
  • Inventor(s): 渡辺賢二
  • Industrial Property Rights Holder: 渡辺賢二
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2019-027695
  • Filing Date: 2019
• [Patent(Industrial Property Rights)] コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブ (2018)
  • Inventor(s): 渡辺賢二
  • Industrial Property Rights Holder: 渡辺賢二
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2018
  • Overseas