Visualization and photomanipulation of migrating neuronal cells and surrounded field during the formation of brain tissue

• Project Area: Interplay of developmental clock and extracellular environment in brain formation
• Project/Area Number: 16H06487
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松田 知己 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50419206)
• Project Period (FY): 2016-06-30 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥84,760,000 (Direct Cost: ¥65,200,000、Indirect Cost: ¥19,560,000); Fiscal Year 2020: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2019: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2018: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2017: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2016: ¥26,520,000 (Direct Cost: ¥20,400,000、Indirect Cost: ¥6,120,000)
• Keywords: ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 生物発光 / 細胞動態 / 化学発光

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、場（細胞外環境）と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展に不可欠な、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を捉えるライブイメージングツールの開発を行なっている。
研究グループの着想に基づいたイメージングツールとして、昨年度より開発を行なっている蛍光と化学発光の双方の検出モードにおいてCa2+濃度変化を観測することのできるバイモーダルセンサーの性能評価を行なった。HeLa細胞および分散培養したラット海馬神経細胞に発現させ、いずれの検出モードにおいてもCa2+濃度変化を観測することができることを確認し、成果をまとめて論文発表した。
領域研究者同士の情報交換から着想を得たイメージングツールとして開発中のN-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについて、昨年度は二量体形成により蛍光発光するようになるβバレル型蛍光タンパク質のペア（ddGFP）を用いたプローブのプロトタイプを作製した。本年度は、N-カドヘリン中のddGFPの挿入位置やリンカー配列を変化させたプローブの遺伝子コンストラクトを作製し、培養細胞を用いたイメージングでの評価に基づく最適化を行い、細胞相互作用に伴う蛍光強度の増大の大きなプローブを得ることができた。さらに、計画班の仲嶋班と共同で、分散培養した神経細胞の相互作用部位で特異的な蛍光シグナルが出現することを確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

蛍光と化学発光の双方の検出モードにおいてCa2+濃度変化を観測することのできるバイモーダルセンサーに関して、HeLa細胞に発現させてヒスタミン刺激によるCa2+濃度振動を双方の検出モードで観測することができることを確認した。さらに、分散培養したラット海馬神経細胞で、双方の検出モードで神経の自発発火に伴うCa2+濃度変化を観測できること、そして化学発光モードでは共発現させた光遺伝学ツールのチャネルロドプシンによるCa2+濃度の光操作と併用可能であることを確認し、それまでの結果をまとめて論文発表するに至った。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、昨年度作製したddGFPペアを用いたプロトタイプを元に、N-カドヘリン細胞外ドメイン上のddGFP挿入位置をシフトさせた変異体、リンカーを挿入した変異体を作製し、HEK293細胞に発現させて細胞接触界面での蛍光強度を指標に評価を行い、最適化を行なった。また、N-カドヘリン二量体結合界面のアミノ酸残基に変異導入すると蛍光が見られなくなったことから、相互作用特異的に蛍光検出できていることが確認できた。
以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。

Strategy for Future Research Activity

N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブに関しては、神経細胞での評価を計画班仲嶋班と共同で、多細胞からなるオルガノイド内での２光子顕微鏡観察下の評価を計画班永樂班と共同で行う。さらに、相互作用の検出が可逆的に行うことができるかどうかを、キレート剤によりN-カドヘリンから相互作用に必須のCa2+を取り去った際のシグナル減衰によって評価する。
また、領域研究者同士の情報交換から着想を得た、脊椎動物の組織や器官の形形成で重要な役割を担っている細胞間の張力に関する情報を得るための、メカニカルストレス応答分子YAPのリン酸化状態を可視化するプローブの開発を行う。

Research Products

• [Journal Article] Hierarchical Development of Motile Polarity in Durotactic Cells Just Crossing an Elasticity Boundary (2020)
  • Author(s): Thasaneeya Kuboki, Hiroyuki Ebata, Tomoki Matsuda, Yoshiyuki Arai, Takeharu Nagai, Satoru Kidoaki
  • Journal Title: Cell Struct. Funct. Volume: 45 Issue: 1 Pages: 33-43
  • DOI: 10.1247/csf.19040
  • ISSN: 0386-7196, 1347-3700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Visible-wavelength two-photon excitation microscopy with multifocus scanning for volumetric live-cell imaging (2019)
  • Author(s): Ryosuke Oketani, Haruka Suda, Kumiko Uegaki, Toshiki Kubo, Tomoki Matsuda, Masahito Yamanaka, Yoshiyuki Arai, Nicholas I. Smith, Takeharu Nagai, Katsumasa Fujita
  • Journal Title: Journal of Biomedical Optics Volume: 25 Pages: 014502-014502
  • DOI: 10.1117/1.jbo.25.1.014502
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Acid-Tolerant Reversibly Switchable Green Fluorescent Protein for Super-resolution Imaging under Acidic Conditions (2019)
  • Author(s): Shinoda Hajime、Lu Kai、Nakashima Ryosuke、Wazawa Tetsuichi、Noguchi Kosuke、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Cell Chemical Biology Volume: 26
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2019.07.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetically encoded fluorescence/bioluminescence bimodal indicators for Ca2+ imaging (2019)
  • Author(s): Israt Farhana, Md Nadim Hossain, Kazushi Suzuki,Tomoki Matsuda, Takeharu Nagai
  • Journal Title: ACS Sensors Volume: 4 Pages: 1825-1834
  • DOI: 10.1021/acssensors.9b00531
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Bioluminescent Low-Affinity Ca2+ Indicator for ER with Multicolor Calcium Imaging in Single Living Cells (2018)
  • Author(s): Hossain Md Nadim、Suzuki Kazushi、Iwano Megumi、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 13 Pages: 1862-1871
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b01014
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation (2018)
  • Author(s): Riani Yemima Dani、Matsuda Tomoki、Takemoto Kiwamu、Nagai Takeharu
  • Journal Title: BMC Biology Volume: 16 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1186/s12915-018-0514-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An improved inverse-type Ca2+ indicator can detect putative neuronal inhibition in Caenorhabditis elegans by increasing signal intensity upon Ca2+ decrease (2018)
  • Author(s): Hara-Kuge Sayuri、Nishihara Tomonobu、Matsuda Tomoki、Kitazono Tomohiro、Teramoto Takayuki、Nagai Takeharu、Ishihara Takeshi
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 13
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0194707
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Uninterrupted monitoring of drug effects in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with bioluminescence Ca2+ microscopy (2018)
  • Author(s): Suzuki Kazushi、Onishi Takahito、Nakada Chieko、Takei Shunsuke、Daniels Matthew J.、Nakano Masahiro、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: BMC Research Notes Volume: 11 Pages: 313-313
  • DOI: 10.1186/s13104-018-3421-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Spontaneously Blinking Fluorescent Protein for Simple Single Laser Super-Resolution Live Cell Imaging (2018)
  • Author(s): Arai Yoshiyuki、Takauchi Hiroki、Ogami Yuhei、Fujiwara Satsuki、Nakano Masahiro、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 13 Pages: 1938-1943
  • DOI: 10.1021/acschembio.8b00200
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa (2018)
  • Author(s): Shinoda Hajime、Ma Yuanqing、Nakashima Ryosuke、Sakurai Keisuke、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Cell Chemical Biology Volume: 25
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2017.12.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Transient Rise in Free Mg 2+ Ions Released from ATP-Mg Hydrolysis Contributes to Mitotic Chromosome Condensation (2018)
  • Author(s): Maeshima Kazuhiro、Matsuda Tomoki、Shindo Yutaka、Imamura Hiromi、Tamura Sachiko、Imai Ryosuke、Kawakami Syoji、Nagashima Ryosuke、Soga Tomoyoshi、Noji Hiroyuki、Oka Kotaro、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Current Biology Volume: 28 Pages: 444-451
  • DOI: 10.1016/j.cub.2017.12.035
  • NAID: 120006380520
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Methods for monitoring signaling molecules in cellular compartments (2017)
  • Author(s): Agetsuma Masakazu、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Cell Calcium Volume: 64 Pages: 12-19
  • DOI: 10.1016/j.ceca.2016.12.002
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Acid-resistant Reversibly Switchable Green Fluorescent Protein for Super-resolution Imaging in Acidic Environments (2019)
  • Author(s): Hajime Shinoda, Ryosuke Nakashima, Tetsuichi Wazawa, Kosuke Noguchi, Tomoki Matsuda, Takeharu Nagai
  • Organizer: Focus on Microscope, London, United Kigdom
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 光刺激によりタンパク質機能阻害・細胞死を誘導する単量体光増感緑色蛍光タンパク質 (2019)
  • Author(s): Yemima Dani Riani, 松田 知己, 竹本 研, 永井 健治
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 神戸国際会議場
• [Presentation] Monomeric green fluorescent protein based photosensitizer for photo-inducible protein inactivation and cell death (2019)
  • Author(s): Tomoki Matsuda, Yemima Dani Riani, Kiwamu Takemoto, Takeharu Nagai
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会, 宮崎県・シーガイアコンベンションセンター
• [Presentation] Acid-tolerant Reversibly Switchable Green Fluorescent Protein for Super-resolution Imaging in Acidic Conditions (2019)
  • Author(s): Hajime Shinoda, Kai Lu, Ryosuke Nakashima, Tetsuichi Wazawa, Kosuke Noguchi, Tomoki Matsuda, Takaharu Nagai
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会, 宮崎県・シーガイアコンベンションセンター
• [Presentation] Fluorescent Ca2+ indicators for multiplexed super-resolution imaging at nanoscopic cellular domain (2019)
  • Author(s): Kai Lu, Tomoki Matsuda, Tetsuichi Wazawa, Takeharu Nagai
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会, 宮崎県・シーガイアコンベンションセンター
• [Presentation] Photosensitizing green fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell death Presenter (2019)
  • Author(s): Tomoki Matsuda, Yemima Dani Riani, Kiwamu Takemoto, Takeharu Nagai
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会, 福岡国際会議場
• [Presentation] A bimodal bioluminescent Ca2+ indicator toward spatiotemporally-scalable imaging (2019)
  • Author(s): Tomoki Matsuda, Israt Farhana, Kazhshi Suzuki and Takeharu Nagai
  • Organizer: SPIE. PHOTONICS WEST BIOS, The Moscone Center San Francisco, United States
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Bimodal Ca2+ indicator toward spatiotemporally-scalable imaging (2018)
  • Author(s): Israt Farhana, Kazushi Suzuki, Tomoki Matsuda, Takeharu Nagai
  • Organizer: 生理学研究所研究会, 生理学研究所
• [Presentation] Fluorescent and Bioluminescent Protein Based Probes for Visualization of Biological events (2018)
  • Author(s): Tomoki Matsuda
  • Organizer: 24th iCeMS International Symposium, iCeMS Kyoto University
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 蛍光タンパク質とハサミは使いよう (2018)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 日本化学会生体機能関連化学部会若手の会, ANA ホリデイ・イン リゾート 宮崎
  • Invited
• [Presentation] ライブイメージングツール開発のための蛍光・生物発光蛋白質工学 (2018)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 第18回 日本蛋白質科学会年会, 朱鷺メッセ
• [Presentation] 光スイッチング Ca2+指示薬 -超解像機能イメージングを目指して- (2017)
  • Author(s): 松田 知己、藤原 沙都姫、永井 健治
  • Organizer: 生理学研究所研究会「シグナル動態の可視化と操作に基づく多階層機能解析の新展開」, 生理学研究所
• [Presentation] 酸性オルガネラ内機能イメージングのための、耐酸性GFP の開発 (2017)
  • Author(s): 篠田 肇、Yuanqing Ma、中島 良介、櫻井 啓介、松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 生理学研究所研究会「シグナル動態の可視化と操作に基づく多階層機能解析の新展開」, 生理学研究所
• [Presentation] Development of chemiluminescent low affinity Ca2+ indicators applicable to analyzing Ca2+ dynamics in endoplasmic reticulum (2017)
  • Author(s): Nadim H、鈴木 和志、岩野 恵、松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 生理学研究所研究会「シグナル動態の可視化と操作に基づく多階層機能解析の新展開」, 生理学研究所
• [Presentation] ハナガサクラゲ由来の耐酸性・単量体型GFP (2017)
  • Author(s): 篠田 肇、Ma Yuanqing、中島 良介、櫻井 啓介、松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 第55回日本生物物理学会年会, 熊本大学
• [Presentation] Multicolor Bioluminescent Calcium Imaging Across Three Orders of [Ca2+] Magnitude in Single Living Cells (2017)
  • Author(s): Nadim H, Suzuki K, Iwano M, Matsuda T, Nagai T.
  • Organizer: 20th International Symposium on Calcium Binding Proteins and Calcium Function in Health and Disease, Awaji Yumebutai
• [Presentation] Fluorescent/Bioluminescent Protein-Based Ca2+ Probes and Photo Manipulation for Imaging of Physiological Functions (2017)
  • Author(s): Matsuda T, Nagai T.
  • Organizer: 20th International Symposium on Calcium Binding Proteins and Calcium Function in Health and Disease, Awaji Yumebutai
  • Invited
• [Presentation] 生理機能イメージングのための蛍光・発光タンパク質を用いたCa2+プローブと光操作 (2017)
  • Author(s): 松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 2017年度生命科学系学会合同年次大会, 神戸ポートアイランド
• [Presentation] Development of Chemiluminescent Ca2+ Indicators with Expanded Dynamic Range (2016)
  • Author(s): Mai Ashitani, Kazushi Suzuki, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium “Molecular Technology Frontiers towards IoT World”
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Acid resistant monomeric GFP derived from Olindias formosa (2016)
  • Author(s): Hajime Shinoda , Yuanqing Ma, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Akihito Yamaguchi, Tomoki Matsuda, Takeharu Nagai
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium “Molecular Technology Frontiers towards IoT World”
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of Bioluminescent Low Affinity Ca2+ Indicators Applicable to Analysis of Ca2+ Dynamics in Endoplasmic Reticulum (2016)
  • Author(s): Nadim Hossain, Kazushi Suzuki, Megumi Iwano, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium “Molecular Technology Frontiers towards IoT World”
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 耐酸性・単量体型緑色蛍光タンパク質Gamillusの開発
  • URL: https://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/fluorescentprotein.html
• [Remarks] 発光・蛍光タンパク質プローブの開発 耐酸性・単量体型緑色蛍光タンパク質Gamillusの開発
  • URL: https://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/research_101205_1.html
• [Remarks] 発光・蛍光タンパク質プローブの開発 耐酸性・単量体型緑色蛍光タンパク質Gamillusの開発
  • URL: http://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/research_101205_1.html