Visualization and photomanipulation of migrating neuronal cells and surrounded field during the formation of brain tissue

• Project Area: Interplay of developmental clock and extracellular environment in brain formation
• Project/Area Number: 16H06487
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松田 知己 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50419206)
• Project Period (FY): 2016-06-30 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥84,760,000 (Direct Cost: ¥65,200,000、Indirect Cost: ¥19,560,000); Fiscal Year 2020: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2019: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2018: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2017: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2016: ¥26,520,000 (Direct Cost: ¥20,400,000、Indirect Cost: ¥6,120,000)
• Keywords: ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 生物発光 / 細胞動態 / 化学発光

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、場（細胞外環境）と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展に不可欠な、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を捉えるライブイメージングツールの開発を行なっている。
研究グループの着想に基づいたイメージングツールとして、小胞体等の高Ca2+濃度の細胞内小器官でのイメージングに適した低親和性の化学発光Ca2+センサー、および光刺激により活性酸素種を産生して近傍のタンパク質を破壊する緑色蛍光タンパク質に関する論文を発表した。また、蛍光と化学発光のどちらの検出モードにおいてもCa2+濃度変化を観測することのできるバイモーダルセンサーに関して本年度から開発を開始した。蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの両末端に、分割した化学発光タンパク質の片側ずつをそれぞれ融合したコンストラクトをデザインして開発を進めた。ドメイン間のリンカーアミノ酸配列を改良して、蛍光モードでは既存の蛍光Ca2+センサーと同様の、化学発光モードでは既存の生物発光Ca2+センサー中で最大のダイナミックレンジを示すセンサーを得た。
領域研究者同士の情報交換から着想を得たイメージングツールとして開発中のN-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについて、分割したニホンウナギ由来緑色蛍光タンパク質UnaGをカドヘリンに挿入したプローブを検討していた。HEK293T細胞内でカドヘリンと融合させた各断片を共発現させた場合にはシグナルを確認することができたものの、各断片を別々の細胞に発現させて細胞間相互作用の検出を試みた場合にシグナルを検出することが出来なかった。そこで、二量体形成により蛍光発光するようになるβバレル型蛍光タンパク質のペア（ddGFP）を用いたプローブを新たに作製し、細胞間相互作用を検出することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

低親和性の化学発光Ca2+センサー、光刺激により活性酸素を産生する緑色蛍光タンパク質といった新規プローブに関して論文発表に至っている。本年度から開発を開始した蛍光・化学発光バイモーダルセンサーに関しては、予定通りに、精製タンパク質を用いたアッセイで蛍光モード・化学発光モードのいずれにおいても大きなシグナル強度変化を起こすセンサーを得ることができた。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、昨年から開発を進めていたニホンウナギ由来の蛍光タンパク質を用いたプローブを検討していたものの検出がうまくいかなかった。しかし、新たに二量体形成により発光する蛍光タンパク質のペアを用いることによりそれを克服することに成功している。
以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。

Strategy for Future Research Activity

蛍光・化学発光バイモーダルセンサーに関しては、本年度の精製タンパク質を用いたアッセイで、蛍光・化学発光モードのいずれにおいてもCa2+の有無で大きな蛍光強度変化を起こしたコンストラクトについて細胞内での評価を行う。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブに関しては、本年度にプロトタイプの作製に成功した、二量体形成により蛍光発光することのできる蛍光タンパク質のペアを用いたプローブのさらなる改良を行い、さらに分散培養した神経細胞やスライスカルチャー内での評価を行う。

Research Products

• [Journal Article] Bioluminescent Low-Affinity Ca2+ Indicator for ER with Multicolor Calcium Imaging in Single Living Cells (2018)
  • Author(s): Hossain Md Nadim、Suzuki Kazushi、Iwano Megumi、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 13 Pages: 1862-1871
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b01014
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation (2018)
  • Author(s): Riani Yemima Dani、Matsuda Tomoki、Takemoto Kiwamu、Nagai Takeharu
  • Journal Title: BMC Biology Volume: 16 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1186/s12915-018-0514-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An improved inverse-type Ca2+ indicator can detect putative neuronal inhibition in Caenorhabditis elegans by increasing signal intensity upon Ca2+ decrease (2018)
  • Author(s): Hara-Kuge Sayuri、Nishihara Tomonobu、Matsuda Tomoki、Kitazono Tomohiro、Teramoto Takayuki、Nagai Takeharu、Ishihara Takeshi
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 13
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0194707
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Uninterrupted monitoring of drug effects in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with bioluminescence Ca2+ microscopy (2018)
  • Author(s): Suzuki Kazushi、Onishi Takahito、Nakada Chieko、Takei Shunsuke、Daniels Matthew J.、Nakano Masahiro、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: BMC Research Notes Volume: 11 Pages: 313-313
  • DOI: 10.1186/s13104-018-3421-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Spontaneously Blinking Fluorescent Protein for Simple Single Laser Super-Resolution Live Cell Imaging (2018)
  • Author(s): Arai Yoshiyuki、Takauchi Hiroki、Ogami Yuhei、Fujiwara Satsuki、Nakano Masahiro、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 13 Pages: 1938-1943
  • DOI: 10.1021/acschembio.8b00200
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa (2018)
  • Author(s): Shinoda Hajime、Ma Yuanqing、Nakashima Ryosuke、Sakurai Keisuke、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Cell Chemical Biology Volume: 25
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2017.12.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Transient Rise in Free Mg2+ Ions Released from ATP-Mg Hydrolysis Contributes to Mitotic Chromosome Condensation (2018)
  • Author(s): Maeshima Kazuhiro、Matsuda Tomoki、Shindo Yutaka、Imamura Hiromi、Tamura Sachiko、Imai Ryosuke、Kawakami Syoji、Nagashima Ryosuke、Soga Tomoyoshi、Noji Hiroyuki、Oka Kotaro、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Current Biology Volume: 28 Pages: 444-451
  • DOI: 10.1016/j.cub.2017.12.035
  • NAID: 120006380520
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Methods for monitoring signaling molecules in cellular compartments (2017)
  • Author(s): Agetsuma Masakazu、Matsuda Tomoki、Nagai Takeharu
  • Journal Title: Cell Calcium Volume: 64 Pages: 12-19
  • DOI: 10.1016/j.ceca.2016.12.002
  • Peer Reviewed
• [Presentation] A bimodal bioluminescent Ca2+ indicator toward spatiotemporally-scalable imaging (2019)
  • Author(s): Tomoki Matsuda, Israt Farhana, Kazhshi Suzuki and Takeharu Nagai
  • Organizer: SPIE. PHOTONICS WEST BIOS, The Moscone Center San Francisco, United States
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Bimodal Ca2+ indicator toward spatiotemporally-scalable imaging (2018)
  • Author(s): Israt Farhana, Kazushi Suzuki, Tomoki Matsuda, Takeharu Nagai
  • Organizer: 生理学研究所研究会, 生理学研究所
• [Presentation] Fluorescent and Bioluminescent Protein Based Probes for Visualization of Biological events (2018)
  • Author(s): Tomoki Matsuda
  • Organizer: 24th iCeMS International Symposium, iCeMS Kyoto University
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 蛍光タンパク質とハサミは使いよう (2018)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 日本化学会生体機能関連化学部会若手の会, ANA ホリデイ・イン リゾート 宮崎
  • Invited
• [Presentation] ライブイメージングツール開発のための蛍光・生物発光蛋白質工学 (2018)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 第18回 日本蛋白質科学会年会, 朱鷺メッセ
• [Presentation] 光スイッチング Ca2+指示薬 -超解像機能イメージングを目指して- (2017)
  • Author(s): 松田 知己、藤原 沙都姫、永井 健治
  • Organizer: 生理学研究所研究会「シグナル動態の可視化と操作に基づく多階層機能解析の新展開」, 生理学研究所
• [Presentation] 酸性オルガネラ内機能イメージングのための、耐酸性GFP の開発 (2017)
  • Author(s): 篠田 肇、Yuanqing Ma、中島 良介、櫻井 啓介、松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 生理学研究所研究会「シグナル動態の可視化と操作に基づく多階層機能解析の新展開」, 生理学研究所
• [Presentation] Development of chemiluminescent low affinity Ca2+ indicators applicable to analyzing Ca2+ dynamics in endoplasmic reticulum (2017)
  • Author(s): Nadim H、鈴木 和志、岩野 恵、松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 生理学研究所研究会「シグナル動態の可視化と操作に基づく多階層機能解析の新展開」, 生理学研究所
• [Presentation] ハナガサクラゲ由来の耐酸性・単量体型GFP (2017)
  • Author(s): 篠田 肇、Ma Yuanqing、中島 良介、櫻井 啓介、松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 第55回日本生物物理学会年会, 熊本大学
• [Presentation] Multicolor Bioluminescent Calcium Imaging Across Three Orders of [Ca2+] Magnitude in Single Living Cells (2017)
  • Author(s): Nadim H, Suzuki K, Iwano M, Matsuda T, Nagai T.
  • Organizer: 20th International Symposium on Calcium Binding Proteins and Calcium Function in Health and Disease, Awaji Yumebutai
• [Presentation] Fluorescent/Bioluminescent Protein-Based Ca2+ Probes and Photo Manipulation for Imaging of Physiological Functions (2017)
  • Author(s): Matsuda T, Nagai T.
  • Organizer: 20th International Symposium on Calcium Binding Proteins and Calcium Function in Health and Disease, Awaji Yumebutai
  • Invited
• [Presentation] 生理機能イメージングのための蛍光・発光タンパク質を用いたCa2+プローブと光操作 (2017)
  • Author(s): 松田 知己、永井 健治
  • Organizer: 2017年度生命科学系学会合同年次大会, 神戸ポートアイランド
• [Presentation] Development of Chemiluminescent Ca2+ Indicators with Expanded Dynamic Range (2016)
  • Author(s): Mai Ashitani, Kazushi Suzuki, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium “Molecular Technology Frontiers towards IoT World”
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Acid resistant monomeric GFP derived from Olindias formosa (2016)
  • Author(s): Hajime Shinoda , Yuanqing Ma, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Akihito Yamaguchi, Tomoki Matsuda, Takeharu Nagai
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium “Molecular Technology Frontiers towards IoT World”
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of Bioluminescent Low Affinity Ca2+ Indicators Applicable to Analysis of Ca2+ Dynamics in Endoplasmic Reticulum (2016)
  • Author(s): Nadim Hossain, Kazushi Suzuki, Megumi Iwano, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium “Molecular Technology Frontiers towards IoT World”
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 発光・蛍光タンパク質プローブの開発 耐酸性・単量体型緑色蛍光タンパク質Gamillusの開発
  • URL: https://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/research_101205_1.html
• [Remarks] 発光・蛍光タンパク質プローブの開発 耐酸性・単量体型緑色蛍光タンパク質Gamillusの開発
  • URL: http://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/research_101205_1.html