Single cell manipulation and gene expression analysis for "Singularity Biology"

• Project Area: Singularity biology
• Project/Area Number: 18H05411
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 城口 克之 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00454059)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥98,670,000 (Direct Cost: ¥75,900,000、Indirect Cost: ¥22,770,000); Fiscal Year 2022: ¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000); Fiscal Year 2021: ¥18,200,000 (Direct Cost: ¥14,000,000、Indirect Cost: ¥4,200,000); Fiscal Year 2020: ¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000); Fiscal Year 2019: ¥19,240,000 (Direct Cost: ¥14,800,000、Indirect Cost: ¥4,440,000); Fiscal Year 2018: ¥26,650,000 (Direct Cost: ¥20,500,000、Indirect Cost: ¥6,150,000)
• Keywords: １細胞解析 / 細胞操作 / 細胞分取 / 遺伝子発現解析 / バイオイメージング / 一細胞解析 / シークエンシング / 深層学習 / 血液細胞 / 免疫細胞 / RNAシークエンシング / １細胞操作 / 自動化 / 遺伝子発現 / 網羅的遺伝子発現解析 / 次世代シークエンサ

Outline of Annual Research Achievements

“シンギュラリティ生物学”の創生に向けて、本研究では、シンギュラリティ細胞やシンギュラリティ現象が起きる際の細胞の内部状態（遺伝子発現）はどうなっているのか？　シンギュラリティ細胞が出現する時の最初の変化は何なのか？　という問いに答えるための研究を行っている。具体的には、イメージングで特定した細胞を分取して網羅的遺伝子発現解析を行うシステムを開発し、領域内で開発する広視野顕微鏡に実装する。これにより、新学術領域内外の研究者が対象としているシンギュラリティ現象を解析して、シンギュラリティ細胞の分子マーカーを決定するとともに、シンギュラリティ現象をもたらすメカニズムを分子（遺伝子）レベルで理解することを目的としている。
本年度は、実際に1,000以上の培養細胞について観察・分取し、その後に網羅的遺伝子発現解析を実施した。細胞を適切にラベルすることにより、観察した細胞画像と網羅的遺伝子発現解析の結果を間違いなく対応できることが確認できた。また、マウスの血液細胞に対しても同様の実験を実施し、本システムが広い範囲の細胞種に応用できることを示すことができた。得られたデータに対して適切な深層学習のモデルとパラメータを選定することで、深層学習を用いて細胞画像から遺伝子発現状態を推定することができた。これは、網羅的な計測から得られる細胞の内部状態を、細胞を壊さずに知ることができる画期的な成果である。さらに、本手法を広視野顕微鏡に実装するため、細胞分取時の位置制御などのシステムを改良した。細胞分取における共同研究も実施した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ニードルの位置を適切に操作することで、タイムラプス撮影した細胞を分取し、細胞の動態と遺伝子発現解析をリンクすることが出来た。さらに、システムの応用例を示すために、マウスのプライマリ細胞での計測を実施した。適切な深層学習のモデルを選定し、パラメータも検討した結果、細胞画像から遺伝子発現状態を推定することが出来ている。また、ニードルの形状や操作の条件を検討し、細胞の真上からニードルをアクセスさせることなどにより、より密度の高い条件から細胞を分取することが可能になった。
ニードルを広い範囲で操作できるソフトウェアを構築した。今後、AMATERASへ実装する。
共同研究の依頼があり、細胞の分取条件を検討し、細胞の調製法や染色条件などについてフィードバックを行った。

Strategy for Future Research Activity

細胞の内部状態の推定：顕微鏡イメージングで同定・分取した細胞の遺伝子発現を解析するシステムを用いて、遺伝子発現状態がどの程度異なった場合に、その違いを細胞画像から推定できるかを評価する。細胞画像から個々の遺伝子の発現量がどの程度推定できるかを評価する。セルライン、マウスのプライマリ細胞において、細胞画像から遺伝子発現状態を推定した結果をまとめて論文を投稿する。
細胞分取システムの改良とAMATERASへの実装：広範囲にニードルを操作できるようにしたデバイスをAMATERASに実装し、AMATERASで観察した細胞を分取する。
領域内外でのサンプル解析における連携：
領域内外の共同研究者から依頼があるため、持ち込まれるサンプルの計測、解析を継続して実施していく。

Research Products

• [Journal Article] Different cell imaging methods did not significantly improve immune cell image classification performance (2022)
  • Author(s): Ogawa Taisaku、Ochiai Koji、Iwata Tomoharu、Ikawa Tomokatsu、Tsuzuki Taku、Shiroguchi Katsuyuki、Takahashi Koichi
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 17 Pages: e0262397
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0262397
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High-throughput identification and quantification of single bacterial cells in the microbiota (2022)
  • Author(s): Jin Jianshi、Yamamoto Reiko、Takeuchi Tadashi、Cui Guangwei、Miyauchi Eiji、Hojo Nozomi、Ikuta Koichi、Ohno Hiroshi、Shiroguchi Katsuyuki
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Pages: 863
  • DOI: 10.1038/s41467-022-28426-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mitochondrial reactive oxygen species trigger metformin-dependent antitumor immunity via activation of Nrf2/mTORC1/p62 axis in tumor-infiltrating CD8T lymphocytes (2021)
  • Author(s): Nishida Mikako、Yamashita Nahoko、Ogawa Taisaku、Koseki Keita、Warabi Eiji、Ohue Tomoyuki、Komatsu Masaaki、Matsushita Hirokazu、Kakimi Kazuhiro、Kawakami Eiryo、Shiroguchi Katsuyuki、Udono Heiichiro
  • Journal Title: Journal for ImmunoTherapy of Cancer Volume: 9 Pages: e002954～e002954
  • DOI: 10.1136/jitc-2021-002954
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] B cell-derived GABA elicits IL-10+ macrophages to limit anti-tumour immunity (2021)
  • Author(s): Zhang Baihao、Vogelzang Alexis、Miyajima Michio、Sugiura Yuki、()、Shiroguchi Katsuyuki、()、Fagarasan Sidonia
  • Journal Title: Nature Volume: 599 Pages: 471～476
  • DOI: 10.1038/s41586-021-04082-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Multiomics Investigation Revealing the Characteristics of HIV-1-Infected Cells In Vivo (2020)
  • Author(s): Aso H, Nagaoka S, Kawakami E, Ito J, Islam S, Tan B J Y, Nakaoka S, Ashizaki K, Shiroguchi K, Suzuki Y, Satou Y, Koyanagi Y, Sato K.
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 32 Pages: 107887
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.107887
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] HaloTag-based conjugation of proteins to barcoding-oligonucleotides (2020)
  • Author(s): 3.Yazaki J*, Kawashima Y, Ogawa T, Kobayashi A, Okoshi M, Watanabe T, Yoshida S, Kii I, Egami S, Amagai M, Hosoya T, Shiroguchi K, Ohara O
  • Journal Title: Nucleic Acids Res Volume: 48 Pages: e8
  • DOI: 10.1093/nar/gkz1086
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Osteoprotegerin-dependent M cell self-regulation balances gut infection and immunity (2020)
  • Author(s): 2.Kimura S*, Nakamura Y, Kobayashi N, Shiroguchi K, Kawakami E, Mutoh M, Takahashi-Iwanaga H, Yamada T, Hisamoto M, Nakamura M, Udagawa N, Sato S, Kaisho T, Iwanaga T, Hase K
  • Journal Title: Nat Commun. Volume: 11 Pages: 234
  • DOI: 10.1038/s41467-019-13883-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Runx/Cbfβ complexes protect group 2 innate lymphoid cells from exhausted-like hyporesponsiveness during allergic airway inflammation (2019)
  • Author(s): Miyamoto C., Kojo S., Yamashita M., Moro K., Lacaud G., Shiroguchi K, Taniuchi I., Ebihara T
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 10 Pages: 447
  • DOI: 10.1038/s41467-019-08365-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 実験自動化ロボットの開発と統合データ解析による １細胞decoding (2021)
  • Author(s): 城口克之
  • Organizer: バイオＤＸの最前線 CRESTバイオＤＸキックオフシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] An automated microscopy-based picking system for single cells which links dynamic behavior with whole gene expression (2021)
  • Author(s): Katsuyuki Shiroguchi
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 細胞動態観察・オミックス解析・機械学習を融合した 新規 1 細胞解析法の開発と免疫研究への応用 (2020)
  • Author(s): 城口克之
  • Organizer: 東京理科大学 総合研究院合成生物学研究部門シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] バイオイメージングとRNAシークエンシング（と機械学習）の融合による１細胞動態解析 (2020)
  • Author(s): 城口克之
  • Organizer: 九州大学先導物質化学研究所 非常勤講師セミナー
  • Invited
• [Presentation] １細胞を観て採る自動システム (2020)
  • Author(s): 城口克之
  • Organizer: Laboratory Automation Developers Conference 2020
  • Invited
• [Presentation] １細胞統合解析： ライブイメージングと 網羅的遺伝子発現解析の融合 (2020)
  • Author(s): 城口克之
  • Organizer: 広島県立大学 生命システム科学特別講義
  • Invited
• [Presentation] Development of an automated system to take datasets of images and sequences for the same single cells (2020)
  • Author(s): Taisaku Ogawa, Katsuyuki Shiroguchi
  • Organizer: AGBT2020
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Linking cell dynamics and gene expression by integration of live imaging and RNA sequencing (2019)
  • Author(s): 城口 克之
  • Organizer: LSBM Symposium 2019
  • Invited
• [Presentation] 新規手法開発により生命システムの理解へ迫る：①核酸・細胞の“デジタル”定量法の開発 ②シークエンシングとライブイメージング法の融合 (2019)
  • Author(s): 城口 克之
  • Organizer: 京都大学ウイルス・再生医科学研究所 セミナー
  • Invited
• [Presentation] 細胞動態と遺伝子発現を結ぶイメージングとシークエンシングの統合解析 (2019)
  • Author(s): 城口 克之
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会・第71回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] 顕微鏡ライブイメージングと1細胞RNA-seqを組み合わせた自動化システムの開発とシンギュラリティ生物学への応用 (2019)
  • Author(s): 小川 泰策、城口 克之
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] 細胞動態と遺伝子発現状態を繋ぐ：顕微鏡ライブイメージングと１細胞RNAシークエンシングの融合と自動化 (2019)
  • Author(s): 城口 克之
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会バイオフィジックスセミナー
  • Invited
• [Presentation] Automation of live imaging, single cell picking, and sequencing system (2019)
  • Author(s): Katsuyuki Shiroguchi
  • Organizer: ICSB2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] An automated system of single cell picking and sequencing for dynamic observation of living cells (2018)
  • Author(s): 城口 克之
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] A robotic system for combining single-cell RNA-seq with live cell imaging (2018)
  • Author(s): 小川 泰策, 伊川 友活, 城口 克之
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] 細胞の網羅的遺伝子発現の経時”計測”と未来予測に向けて (2018)
  • Author(s): 城口 克之
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Book] DNA分子バーコード法とその新機能 バイオイノベーションに向けて ～バイテクノロジーの新技術からの新しい視点～ (2019)
  • Author(s): 城口克之、小川泰策
  • Total Pages: 255
  • Publisher: シーエムシー出版
  • ISBN: 978-4-7813-1411-2
• [Book] 1細胞，1分子における核酸配列決定・定量技術の現状と展望 (2018)
  • Author(s): 城口克之
  • Total Pages: 108
  • Publisher: 科学評論社
• [Patent(Industrial Property Rights)] 核酸増幅に関する技術（仮） (2022)
  • Inventor(s): 城口克之、他
  • Industrial Property Rights Holder: 理化学研究所、他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願２０２２－４７２９
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞操作に関する技術（仮） (2020)
  • Inventor(s): 城口克之、他
  • Industrial Property Rights Holder: 理化学研究所、他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP/2020/022448
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞搬送システム (2018)
  • Inventor(s): 城口克之、小川泰策、平藤衛
  • Industrial Property Rights Holder: 理化学研究所、ヨダカ技研（株）
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2018-203728