Development of single-molecule methods measuring energy conversion processes of biological and synthetic molecular engines

• Project Area: Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion
• Project/Area Number: 18H05424
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute for Molecular Science
• Principal Investigator: 飯野 亮太 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 教授 (70403003)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 笠井 倫志 岐阜大学, 糖鎖生命コア研究所, 特任准教授 (20447949)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥125,190,000 (Direct Cost: ¥96,300,000、Indirect Cost: ¥28,890,000); Fiscal Year 2022: ¥24,050,000 (Direct Cost: ¥18,500,000、Indirect Cost: ¥5,550,000); Fiscal Year 2021: ¥23,010,000 (Direct Cost: ¥17,700,000、Indirect Cost: ¥5,310,000); Fiscal Year 2020: ¥23,010,000 (Direct Cost: ¥17,700,000、Indirect Cost: ¥5,310,000); Fiscal Year 2019: ¥22,100,000 (Direct Cost: ¥17,000,000、Indirect Cost: ¥5,100,000); Fiscal Year 2018: ¥33,020,000 (Direct Cost: ¥25,400,000、Indirect Cost: ¥7,620,000)
• Keywords: １分子計測 / 分子モーター / １分子イメージング / 光学顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

(1) A01-1班の金原、公募班の内橋と協力し、生体分子や人工分子のリンカーを用いて2量体化したリニア発動分子キネシンの運動運動特性や協調性を計測した。タンパク質リンカーであるSpyTag-SpyChatcherシステムを用いて2量体化したキネシンが、微小管上を左巻きらせん状にステップ運動することを明らかにした。らせんのピッチは160 nmであり、先行研究で報告されている非従来型キネシンのらせん運動のピッチ（230 nm）よりも大幅に小さいことが明らかとなった。また、人工リンカーであるPEG誘導体で2量体化したハイブリッドキネシンが直進運動することを明らかにした。
(2) 異方的な環境場である生体膜でエネルギー変換を行う回転型生体発動分子V-ATPaseの高速高精度１分子計測を行った。イオンの輸送が回転運動の律速となる変異体の作製に成功し、イオン輸送を担うVo部分のステップ運動を可視化することに初めて成功した。また、ATPを分解するV1部分とVo部分の両方が回転の律速となる条件での１分子計測に成功し、V1とV1のカップリングは比較的硬く、１回転当たりのイオン輸送とAT分解の比が非整数になっていることを明らかにした。さらに、A01-2班が創成した非天然型V1-ATPaseの１分子複合計測を行い、天然型が有しないアロステリ―を非天然型分子が示す機構を明らかにした。
(3) A01-1班が合成した、人工イオンチャネルの動作機構を解明するため、生体膜中での会合体数を調べ、リガンド刺激の有無で比較したが、刺激によって会合体数に大きな変化は見られなかった。蛍光タンパク質を改変したイオンプローブを複数観察したが、S/Nが足りないため、30Hzで時間変化を追跡するためには光学系の更なる改善が必要と考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

(1) 非常に短いピッチでらせん運動を行う非天然2量体化キネシンの創生に成功し、運動素過程の解明に成功した。また、人工合成分子で繋いだ2量体化キネシンがプロセッシブに直進運動することを明らかにした。
(2)　イオン輸送が遅いV-ATPase変異体の作製し、V-ATPaseのVo部分のイオン輸送律速の回転ステップの可視化に成功した。また、V1部分とVo部分のエネルギー変換のカップリングは比較的硬く、１回転当たりに輸送されるイオンの数と分解されるATPの数が非整数となることを明らかにした。さらに、非天然型V1-ATPaseのアロステリ―の機構を１分子計測で明らかにした。
(3) 人工イオンチャネルは、リガンド刺激で会合体数が大きく変化しないことが明らかとなったが、ダイナミクスは不明であるので解明に取り組む。

Strategy for Future Research Activity

(1) リニア型生体発動分子のキネシンは２量体であり、２つの足が協調してレールである微小管上を歩く。しかし、足の繋ぎ方を変えた場合や足の数が増えた場合に協調性がどう変化するのか、運動特性がどう変化するのかは不明な点が多い。今後は、昨年度に得られた非天然2量体化キネシンの運動特性の更なる改善を試みる。また、3量体以上のキネシンの人工多量体を作製し、その運動素過程や多足間の協調の仕組みを明らかにする。さらに、A01-1班と連携し、人工分子を用いて多量体化したハイブリッドキネシンの高速高精度１分子計測法を開発する。
(2) 今後は、回転型生体発動分子V-ATPaseの１分子複合計測に取り組む。まず、変異体よりも回転速度が高い野生型V-ATPaseの運動素過程を解明する。また、マイクロデバイスと組み合わせた複合計測によるイオン輸送の素過程の可視化に取り組む。さらに、A01-2班と連携し、2倍のイオンを輸送する非天然型V-ATPaseの創生と１分子計測に取り組む。
(3) 発動分子の作動機構を解明するため、人工発動分子として、引き続き、A01-1班が作製した人工イオンチャネルを詳しく調べる。また、生体発動分子としては、新たにC01-2班が作製した変異GPCRを１分子で調べる。そのため、GPCRの活性を測定する新たなイメージング手法を開発する。膜電位や膜周辺の環境を捉えるプローブの探索と改変も行う。

Research Products

• [Journal Article] 生きものが機械でもいいじゃない (2021)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Journal Title: Biophysics Volume: 6 Issue: 2 Pages: 077-077
  • DOI: 10.2142/biophys.61.077
  • NAID: 130008002752
  • ISSN: 0582-4052, 1347-4219
  • Open Access
• [Journal Article] 銀, 金, 銀金合金ナノ粒子の光散乱を利用したマルチカラー生体１分子追跡 (2021)
  • Author(s): 安藤潤，飯野亮太
  • Journal Title: フォトニクスニュース Volume: 6 Pages: 132-136
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Combined approach to engineer a highly active mutant of processive chitinase hydrolyzing crystalline chitin (2020)
  • Author(s): Visootsat A, Nakamura A, Wang T-W, Iino R
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 5 Pages: 26807-26816
  • DOI: 10.1021/acsomega.0c03911
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Domain architecture divergence leads to functional divergence in binding and catalytic domains of bacterial and fungal cellobiohydrolases (2020)
  • Author(s): Nakamura A, Ishiwata D, Visootsat A, Uchiyama T, Mizutani K, Kaneko S, Murata T, Igarashi K, Iino R
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 295 Pages: 14606-14617
  • DOI: 10.1074/jbc.ra120.014792
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High-speed single-molecule imaging reveals signal transduction by onduced transbilayer raft phases. (2020)
  • Author(s): I. Koyama-Honda, T. K. Fujiwara, R. S. Kasai, K. G. N. Suzuki, E. Kajikawa, T. A. Tsunoyama, A. Kusumi.
  • Journal Title: Journal of Cell Biology Volume: 219
  • DOI: 10.1083/jcb.202006125
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Synergetic roles of Formyl Peptide Receptor 1 oligomerization in ligand-induced signal transduction (2020)
  • Author(s): Nishiguchi T, Yoshimura H, Kasai RS, Fujiwara TK, Ozawa T
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 15 Pages: 2577-2587
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00631
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A synthetic ion channel with anisotropic ligand response (2020)
  • Author(s): Muraoka Takahiro, Noguchi Daiki, Kasai Rinshi, Sato Kohei, Sasaki Ryo, Tabata Kazuhito, Ekimoto Toru, Ikeguchi Mitsunori, Kamagata Kiyoto, Hoshino Norihisa, Noji Hiroyuki, Akutagawa Tomoyuki, Ichimura Kazuaki, Kinbara Kazushi
  • Journal Title: Nat. Commun. Volume: 11 Pages: 2924-2924
  • DOI: 10.1038/s41467-020-16770-z
  • NAID: 120006878529
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Small stepping motion of processive dynein revealed by load-free high-speed single-particle tracking (2020)
  • Author(s): Ando J, Shima T, Kanazawa R, Shimo-Kon R, Nakamura A, Yamamoto M, Kon T, Iino R
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 10 Pages: 1080-1080
  • DOI: 10.1038/s41598-020-58070-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single-molecule imaging analysis reveals the mechanism of a high-catalytic-activity mutant of chitinase A from Serratia marcescens (2020)
  • Author(s): Visootsat A, Nakamura A, Vignon P, Watanabe H, Uchihashi T, Iino R
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 295 Pages: 1915-1925
  • DOI: 10.1074/jbc.ra119.012078
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Introduction: Molecular Motors (2020)
  • Author(s): Iino Ryota、Kinbara Kazushi、Bryant Zev
  • Journal Title: Chemical Reviews Volume: 120 Pages: 1-4
  • DOI: 10.1021/acs.chemrev.9b00819
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Defining raft domains in the plasma membrane (2020)
  • Author(s): Akihiro Kusumi、Takahiro K. Fujiwara、Taka A. Tsunoyama、Rinshi S. Kasai、An‐An Liu、Koichiro M. Hirosawa、Masanao Kinoshita、Nobuaki Matsumori、Naoko Komura、Hiromune Ando、Kenichi G. N. Suzuki
  • Journal Title: Traffic Volume: 21 Pages: 106-137
  • DOI: 10.1111/tra.12718
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High-speed near-field fluorescence microscopy combined with high-speed atomic force microscopy for biological studies (2020)
  • Author(s): Takayuki Umakoshi, Shingo Fukuda, Ryota Iino, Takayuki Uchihashi, Toshio Ando*
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica acta. General subjects Volume: 印刷中 Pages: 129325-129325
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Multicolor high-speed tracking of single biomolecules with silver, gold, silver-gold alloy nanoparticles (2019)
  • Author(s): Ando J, Nakamura A, Yamamoto M, Song C, Murata K, Iino R
  • Journal Title: ACS Photonics Volume: 6 Pages: 2870-2883
  • DOI: 10.1021/acsphotonics.9b00953
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Simultaneous observation of kinesin-driven microtubule motility and binding of adenosine triphosphate using linear zero-mode waveguides (2018)
  • Author(s): Fujimoto K, Morita Y, Iino R, Tomishige M, Shintaku H, Kotera H, Yokokawa R
  • Journal Title: ACS nano Volume: 12 Pages: 11975-11985
  • DOI: 10.1021/acsnano.8b03803
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Off-axis rotor in Enterococcus hirae V-ATPase visualized by Zernike phase plate single-particle cryo-electron microscopy (2018)
  • Author(s): Tsunoda J., Song C., Imai F. L., Takagi J., Ueno H., Murata T., Iino R., Murata K.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 8 Pages: 15632-15632
  • DOI: 10.1038/s41598-018-33977-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Processive chitinase is Brownian monorail operated by fast catalysis after peeling rail from crystalline chitin (2018)
  • Author(s): Nakamura Akihiko、Okazaki Kei-ichi、Furuta Tadaomi、Sakurai Minoru、Iino Ryota
  • Journal Title: Nature Commun. Volume: 9 Pages: 3814-3814
  • DOI: 10.1038/s41467-018-06362-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Visualization of Functional Structure and Kinetic Dynamics of Cellulases (2018)
  • Author(s): Akihiko Nakamura, Ryota Iino
  • Journal Title: Adv Exp Med Biol. Volume: 1104 Pages: 201-217
  • DOI: 10.1007/978-981-13-2158-0_10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Class-A GPCR Dopamine D2 Receptor Forms Transient Dimers Stabilized by Agonists: Detection by Single-Molecule Tracking (2018)
  • Author(s): Kasai Rinshi S.、Ito Shuichi V.、Awane Ryo M.、Fujiwara Takahiro K.、Kusumi Akihiro
  • Journal Title: Cell Biochem Biophys. Volume: 76 Pages: 29-37
  • DOI: 10.1007/s12013-017-0829-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 生体分子モーターを観る、壊す、創る (2021)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 新学術「生命金属科学」領域会議
  • Invited
• [Presentation] Watching unexpected motions of protein molecular motors (2020)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: Serendipity Symposium 2020
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 生体分子モーターを観る、壊す、創る (2020)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 東北大学大学院工学研究科応用物理学セミナー
  • Invited
• [Presentation] タンパク質分子モーターを観る、壊す、創る (2020)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 東京大学大学院工学系研究科化学生命工学専攻「ハイブリッドレクチャー」
  • Invited
• [Presentation] タンパク質の基礎 (2020)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 新学術領域合同シンポジウム－ソフトロボット学と発動分子科学の境界－
  • Invited
• [Presentation] High-speed atomic force microscopy as a versatile tool to study dynamical and mechanical properties of proteins (2020)
  • Author(s): Christian Ganser, Kimitoshi Takeda, Ryota Iino, Koichi Kato, Takayuki Uchihashi
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [Presentation] Single-molecule analysis of rotation of Enterococcus hirae V-ATPase depending on sodium ion concentration (2020)
  • Author(s): Akihiro Otomo, Tatsuya Iida, Hiroshi Ueno, Takeshi Murata, Ryota Iino
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [Presentation] Combination approach for identification of highly-active mutant of processive chitinase (2020)
  • Author(s): Akasit VISOOTSAT, Akihiko NAKAMURA, Tak-Wai WANG, Ryota IINO
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [Presentation] Single-molecule analysis of artificial kinesin-1 dimers and trimers with different linker lengths (2020)
  • Author(s): Kimitoshi Takeda, Monique Honsa, Akihiko Nakamura, Jun Ando, Ryota Iino
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [Presentation] 蛍光1分子観察法による細胞膜中の分子の動態と機能の解明：会合体形成とダイナミクス (2020)
  • Author(s): 笠井倫志
  • Organizer: 日本化学会秋季事業 第10会 CSJ化学フェスタ2020
  • Invited
• [Presentation] Single molecule observation of adhesion GPCR accumulated at the cell-cell interface (2020)
  • Author(s): Kasai RS, Nemoto YL.
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
• [Presentation] Visualizing Dynamic Motions of Protein Molecular Motors with Plasmonic Nanoprobes (2020)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The 1st International Symposium on Molecular Engine
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Processive chitinase: a burnt-bridge Brownian motor hydrolyzing crystalline polysaccharide (2020)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The symposium "Molecular Motors" at the Biophysical Society 64th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Plasmonic nanoprobes visualizing dynamic motions of single motor proteins (2019)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: Joint Meeting for Young Researchers "Frontiers in Imaging Probes and Technologies"
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Watching motor protein dynamics with plasmonic nanoprobes (2019)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: 2nd East Asian Symposium on Single-Molecule Biological Sciences
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Visualizing dynamic motions of protein molecular motors with plasmonic nanoprobes (2019)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: 2019 Japan-Korea Molecular Science Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Watching dynamic motions of hydrolysis-powered protein motors with plasmonic nanoprobes (2019)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The 10th Toyota RIKEN internatonal workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single-molecule dynamics of motor proteins visualized by plasmonic nanoprobes (2019)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: 2nd NIBB-Princeton Joint Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] プラズモニックナノプローブでタンパク質分子モーターの動きを観る (2019)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: OCU先端光科学シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] プラズモニックナノ粒子を用いた分子モーターの高速高精度１分子イメージング (2019)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 第9回分子モーター討論会
  • Invited
• [Presentation] バイオマス多糖を効率的に分解する生体分子モーターの作動原理 (2019)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 高分子学会バイオミメティクス研究会
  • Invited
• [Presentation] Single-molecule dynamics of protein molecular motors visualized by plasmonic nanoprobes (2019)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The workshop in NCCR
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] １分子計測、構造解析、シミュレーションで探るタンパク質分子モーターの作動機構 (2019)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 第24回べん毛研究交流会
  • Invited
• [Presentation] Molecular engines: An introduction (2018)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The 79th Okazaki Conference: Synthetic, Biological, and Hybrid Molecular Engines
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single-molecular videography of protein molecular motors (2018)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: Telluride Workshop on "Molecular Videography"
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Commonalities and disparities in mechanisms of protein molecular motors revealed by single-molecule imaging analyses with plasmonic nanoprobes (2018)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: 1st SNU Evolutionary Materials Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] バイオマス多糖を効率的に分解する生体分子モーターの作動原理 (2018)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 第67回高分子討論会
  • Invited
• [Presentation] Characterization and engineering of chitin-hydrolyzing Brownian linear motor from marine bacteria (2018)
  • Author(s): Akihiko Nakamura, Veda Boorla, Hiroki Watanabe, Takayuki Uchihashi, Ryota Iino
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] Multi-color single-molecule imaging with silver, gold, and silver/gold-alloy nanoparticles (2018)
  • Author(s): Jun Ando, Akihiko Nakamura, Mayuko Yamamoto, Ryota Iino
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] Single-particle tracking of motor domain of a processive dynein at microsecond time resolution and nanometer localization precision (2018)
  • Author(s): Jun Ando, Tomohiro Shima, Akihiko Nakamura, Akasit Visootsat, Mayuko Yamamoto, Takahide Kon, Ryota Iino
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] Estimating a diffusion model hopping on multiple energy surfaces from trajectories: Toward application to biomolecular motors (2018)
  • Author(s): Kei-ichi Okazaki, Akihiko Nakamura, Ryota Iino
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] Single Particle Analysis of EhV-ATPase by Phase-Plate electron cryo-microscopy (2018)
  • Author(s): Jun Tsunoda, Chihong Song, Yakushiji Fabiana Lica, Takeshi Murata, Hiroshi Ueno, Naoyuki Miyazaki, Kenji Iwasaki, Junichi Takagi, Ryota Iino, Kazuyoshi Murata
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] Transient dimer formation of G-protein coupled receptor: single fluorescent molecule imaging in live cells (2018)
  • Author(s): Kasai RS
  • Organizer: The 3rd Biosignal Research Center International Symposium “Modulation of GPCR signaling by membrane heterogeneity and molecular clustering”
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Gタンパク質共役型受容体の動的なダイマー形成：蛍光1 分子観察法による解明 (2018)
  • Author(s): 笠井倫志
  • Organizer: 日本農芸化学会 中部支部 第184回例会 若手シンポジウム “化学と生物のマリアージュ：若手研究者による生化学研究の新機軸”
  • Invited
• [Presentation] Spontaneous activation in a transient GPCR dimer before ligation as revealed by dual-channel single fluorescent molecule imaging (2018)
  • Author(s): Kasai RS
  • Organizer: 日本生物物理学会第56回年会
• [Presentation] Transient dimers of GPCRs are responsible for triggering GPCRs’ basic constitutive signals - A finding by the two-color single fluorescent-molecule tracking in living cells (2018)
  • Author(s): Kasai RS, Fujiwara TK, Kusumi A
  • Organizer: Cold Spring Harbor meeting: Single Biomolecules
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 分子研飯野グループホームページ
  • URL: https://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/index.html
• [Remarks] 二本足のリニア分子モーターダイニンは小さな歩幅でふらふら歩く（飯野グループら）
  • URL: https://www.ims.ac.jp/news/2020/01/24_4544.html
• [Remarks] 光学顕微鏡によるマルチカラー高速高精度１分子観察を実現（飯野グループら）
  • URL: https://www.ims.ac.jp/news/2019/11/25_4477.html
• [Remarks] 自然科学研究機構 分子科学研究所 飯野グループ
  • URL: https://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/index.html
• [Remarks] キチン加水分解酵素は熱ゆらぎを利用して一方向に動きながら結晶性バイオマスを分解する分子モノレールカー
  • URL: https://www.ims.ac.jp/news/2018/09/19_4057.html
• [Remarks] モータータンパク質とATPの結合を1分子で可視化することに成功
  • URL: https://www.ims.ac.jp/news/2018/12/03_4138.html
• [Funded Workshop] The 1st International Symposium on Molecular Engine (2020)