Biophysical analysis of the cell wall-plasma membrane interface using GFP-based tension and calcium sensors

• Project Area: Elucidation of the strategies of mechanical optimization in plants toward the establishment of the bases for sustainable structure system
• Project/Area Number: 18H05491
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 豊田 正嗣 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (90714402)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥55,640,000 (Direct Cost: ¥42,800,000、Indirect Cost: ¥12,840,000); Fiscal Year 2022: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2021: ¥11,310,000 (Direct Cost: ¥8,700,000、Indirect Cost: ¥2,610,000); Fiscal Year 2020: ¥11,310,000 (Direct Cost: ¥8,700,000、Indirect Cost: ¥2,610,000); Fiscal Year 2019: ¥12,090,000 (Direct Cost: ¥9,300,000、Indirect Cost: ¥2,790,000); Fiscal Year 2018: ¥10,660,000 (Direct Cost: ¥8,200,000、Indirect Cost: ¥2,460,000)
• Keywords: バイオセンサー / カルシウム / イメージング / 植物 / メカノバオロジー / 機械刺激 / 細胞壁 / 張力

Outline of Annual Research Achievements

植物は外力（力学的刺激）を受容して、自立的かつダイナミックに生体構造を変化させる（力学的最適化戦略）。この力学的最適化戦略は、持続可能な（サステナブル）社会・資源・建築を実現するために重要な能力であるが、その根幹を成す植物の力学的刺激受容機構は明らかになっていない。本研究では、外力によって発生する張力およびカルシウムシグナルを可視化するイメージング技術を開発し、植物の力学的刺激受容・フィードバック機構を解明する。さらに、これらの新しい技術を用いて、生きた植物の構造力学的パラメーターを取得し、力学的最適化を可能にする植物の原理を抽出することで、次世代のサステナブル建築構造モデルを構築する。
今年度は、生体内に発生する張力に応答して蛍光強度が変化するGFP型張力センサーの開発、広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムを用いた、大型植物体のリアルタイムカルシウムイメージングなどを行った。GFP型張力センサーについては、セルロースなどの細胞壁成分に特異的に結合するタンパク質を融合させ、in vitroでの結合能を確認した。広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムを用いたリアルタイムカルシウムイメージングについては、高さが30cm以上あるタバコなどの大型植物を自然な状態（自立した状態）で栽培しながら、カルシウムシグナルの可視化に成功した。カルシウムイメージングのデータ（動画）や新しい蛍光顕微鏡システムは、NHK総合「世界！オモシロ学者のスゴ動画祭」やBSフジ「ガリレオX」などのメディアに取り上げられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

GFP型張力センサーについては、セルロースなどの細胞壁成分に特異的に結合するタンパク質を複数選抜し、フレキシブルなリンカーを介してGFPの蛍光センサードメインに連結させた。まずは、この状態で蛍光を発していることを確認し、次に、セルロースなどに結合するか、否かを確認した。木材由来のセルロースなどを用いたin vitroアッセイを行ったところ、GFP型張力センサーは細胞壁成分への特異的結合能を有していることが明らかになった。
一般的な顕微鏡は、試料を真上または真下から観察するために設計されており、自立している植物を真横から観察することは難しい。そこで、背丈が30 cm を超えるようなタバコやオジギソウなどの大型植物を、任意の角度で真横から蛍光イメージングができる広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムを構築した。このイメージングシステムを用いて、接触や振動などの力学的刺激に対するカルシウムシグナルをリアルタイム（最大40フレーム/秒）でイメージングすることに成功した。さらに、同じ大型植物を用いて、アミノ酸などを投与することで発生する全身性の高速カルシウムシグナルの可視化にも成功した。

Strategy for Future Research Activity

GFP型張力センサーに関しては、蛍光センサードメイン・フレキシブルリンカー・細胞壁結合ドメインなどの重要部位が確定した。in vitroでは、既に蛍光および細胞壁への結合能が確認されているので、in vivoの実験系として、タバコBY-2細胞やシロイヌナズナなどの植物体でのイメージングへと移行していく。
広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムは、大型植物を用いた任意の角度からのリアルタイムイメージングに成功しており、刺激と応答に関する定量的な解析を行っていく。自立した状態で、様々な力学的刺激を与え、その時空間的なイメージングデータを解析していくことで、生きた植物の構造力学的パラメーターを取得していく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Wisconsin- Madison(米国)
• [Int'l Joint Research] University of Helsinki(フィンランド)
• [Int'l Joint Research] University of Toronto(カナダ)
• [Int'l Joint Research] University of Wisconsin- Madison(米国)
• [Int'l Joint Research] University of Helsinki(フィンランド)
• [Int'l Joint Research] University of Toronto(カナダ)
• [Int'l Joint Research] University of Wisconsin-Madison(米国)
• [Int'l Joint Research] Helsinki University(フィンランド)
• [Int'l Joint Research] University of Toronto(カナダ)
• [Journal Article] Gravity sensing in plant and animal cells. (2021)
  • Author(s): Takahashi K, Takahashi H, Furuichi T, Toyota M, Furutani-Seiki M, Kobayashi T, Watanabe-Takano H, Shinohara M, Numaga-Tomita T, Sakaue-Sawano A, Miyawaki A, Naruse K.
  • Journal Title: NPJ. Microgravity Volume: 7 Pages: 2-12
  • DOI: 10.1038/s41526-020-00130-8
  • NAID: 120006959634
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mechanical Signaling in the Sensitive Plant Mimosa pudica L. (2020)
  • Author(s): Hagihara Takuma、Toyota Masatsugu
  • Journal Title: Plants Volume: 9 Pages: 587-587
  • DOI: 10.3390/plants9050587
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Tonoplast-localized Ca2+pumps regulate Ca2+signals during pattern-triggered immunity inArabidopsis thaliana (2020)
  • Author(s): Hilleary Richard、Paez-Valencia Julio、Vens Cullen、Toyota Masatsugu、Palmgren Michael、Gilroy Simon
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 117 Pages: 18849-18857
  • DOI: 10.1073/pnas.2004183117
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Calcium dynamics during trap closure visualized in transgenic Venus flytrap (2020)
  • Author(s): Suda Hiraku、Mano Hiroaki、Toyota Masatsugu、Fukushima Kenji、Mimura Tetsuro、Tsutsui Izuo、Hedrich Rainer、Tamada Yosuke、Hasebe Mitsuyasu
  • Journal Title: Nature Plants Volume: 6 Pages: 1219-1224
  • DOI: 10.1038/s41477-020-00773-1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Micromanipulation of amyloplasts with optical tweezers in <i>Arabidopsis</i> stems (2020)
  • Author(s): Abe Yoshinori、Meguriya Keisuke、Matsuzaki Takahisa、Sugiyama Teruki、Yoshikawa Hiroshi Y.、Morita Miyo Terao、Toyota Masatsugu
  • Journal Title: Plant Biotechnology Volume: 37 Issue: 4 Pages: 405-415
  • DOI: 10.5511/plantbiotechnology.20.1201a
  • NAID: 130007960232
  • ISSN: 1342-4580, 1347-6114
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 若手研究者の現状 ―アメリカでの苦悩と挑戦― (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: 植物の生長調節 Volume: 55 Pages: 70-73
  • NAID: 130008060500
• [Journal Article] CRK2 and C-terminal Phosphorylation of NADPH Oxidase RBOHD Regulate Reactive Oxygen Species Production in Arabidopsis (2020)
  • Author(s): Kimura Sachie、Hunter Kerri、Vaahtera Lauri、Tran Huy Cuong、Citterico Matteo、Vaattovaara Aleksia、Rokka Anne、Stolze Sara Christina、Harzen Anne、Mei?ner Lena、Wilkens Maya Melina Tabea、Hamann Thorsten、Toyota Masatsugu、Nakagami Hirofumi、Wrzaczek Michael
  • Journal Title: Plant Cell Volume: 32 Pages: 1063-1080
  • DOI: 10.1105/tpc.19.00525
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 植物が傷つけられたことを感じて，全身に情報を伝える仕組み (2020)
  • Author(s): TOYOTA Masatsugu
  • Journal Title: KAGAKU TO SEIBUTSU Volume: 58 Issue: 2 Pages: 70-72
  • DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.58.70
  • NAID: 130007979495
  • ISSN: 0453-073X, 1883-6852
• [Journal Article] CRK2 Enhances Salt Tolerance by Regulating Callose Deposition in Connection with PLDα1 (2019)
  • Author(s): Hunter Kerri、Kimura Sachie、Rokka Anne、Tran Huy Cuong、Toyota Masatsugu、Kukkonen Jyrki P.、Wrzaczek Michael
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: 180 Pages: 2004-2021
  • DOI: 10.1104/pp.19.00560
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 「かじられた！」とぺんぺん草もシグナルを送る (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: Nextcom Volume: 39 Pages: 42-43
• [Journal Article] 植物の全身を流れる高速シグナルを見る (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: 日経バイオテク Volume: 902 Pages: 44-46
• [Journal Article] グルタミン酸はカルシウムシグナルを介して植物の全身性傷害防御を引き起こす (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: バイオサイエンスとインダストリー Volume: 77(2) Pages: 134-135
• [Journal Article] 植物におけるカルシウム／グルタミン酸のリアルタイムイメージング (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: バイオサイエンスとインダストリー Volume: 77(2) Pages: 110-111
• [Journal Article] 植物の全身カルシウムイメージング (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: アグリバイオ Volume: 3(2) Pages: 23-27
• [Journal Article] Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling (2018)
  • Author(s): Toyota Masatsugu、Spencer Dirk、Sawai-Toyota Satoe、Wang Jiaqi、Zhang Tong、Koo Abraham J.、Howe Gregg A.、Gilroy Simon
  • Journal Title: Science Volume: 361 Pages: 1112-1115
  • DOI: 10.1126/science.aat7744
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Molecular Mechanisms of Mechanosensing and Mechanotransduction (2018)
  • Author(s): Toyota Masatsugu、Furuichi Takuya、Iida Hidetoshi
  • Journal Title: Plant Biomechanics Volume: - Pages: 375-397
  • DOI: 10.1007/978-3-319-79099-2_17
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] グルタミン酸とカルシウムシグナルを介した傷害応答 (2018)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: 植物の生長調節 Volume: 53(2) Pages: 146-151
  • NAID: 130007553700
• [Journal Article] 植物が傷つけられたことを全身へ伝えるしくみを解明！ (2018)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Journal Title: 月刊「化学」 Volume: 73(11) Pages: 73-73
• [Presentation] Shining light on rapid signal transduction in plants (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会
  • Invited
• [Presentation] 虫にかじられた植物が発する緊急信号を見る (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第84回日本植物学会大会 公開講座「植物はオモシロイ！」
  • Invited
• [Presentation] 大きな植物をまるごと可視化する ～広視野・高速カルシウムイメージングの挑戦～ (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 情報分子可視化技術勉強会
  • Invited
• [Presentation] 広視野カルシウムイメージングで見る植物の虫害防御応答 (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第20回 植物科学シンポジウム2020
  • Invited
• [Presentation] 植物の長距離・高速カルシウムシグナルを可視化する (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 日本応用糖質科学会
  • Invited
• [Presentation] 植物に神経はあるのか？ -長距離・高速Ca2+シグナルを介した植物の虫害抵抗性反応- (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第4回大隅基礎科学創成財団創発セミナー
  • Invited
• [Presentation] Calcium-based intra- and inter-plant communication system (2020)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第61回日本植物生理学会
  • Invited
• [Presentation] Glutamate is a wound signal triggering systemic calcium propagation (2019)
  • Author(s): Toyota M
  • Organizer: The 23rd International Conference on Plant Growth Substances
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Real-time imaging of whole-plant calcium and glutamate dynamics (2019)
  • Author(s): Toyota M
  • Organizer: The 6th International Symposium on Bioimaging The 28th Annual Meeting of the Bioimaging Society of Japan BIOIMAGING 2019
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Long-range, rapid calcium signaling in plants (2019)
  • Author(s): Toyota M
  • Organizer: ViPS Seminar (Viikki Plant Science Centre)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Long-distance, rapid calcium signaling in plant (2019)
  • Author(s): Toyota M
  • Organizer: Frontiers in plant environmental response research: local signaling, long-distance communication and memory for developmental plasticity
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Strategies of mechanical optimization for plant wound responses (2019)
  • Author(s): Toyota M
  • Organizer: Strategies of mechanical optimization in plants
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 植物のメカノバイオロジー -傷害受容を例にして- (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 日本メカノバイオロジー研究会
  • Invited
• [Presentation] Ca2+シグナルを介した植物の全身性傷害応答 (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第32回植物脂質シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] グルタミン酸受容体/カルシウムシグナルを介した植物の全身性傷害応答 (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 令和元年度 日本植物病理学会関東部会
  • Invited
• [Presentation] グルタミン酸受容体を介した植物の長距離カルシウムシグナル (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 日本顕微鏡学会 第62回シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Long-distance Ca2+ transmission via glutamate receptor channels in plants (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会
  • Invited
• [Presentation] GCaMPが切り拓く植物科学の新しい地平線 (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 第100回 埼玉大学脳科学セミナー
  • Invited
• [Presentation] Systemic calcium signaling via glutamate receptor channels in response to mechanical wounding (2019)
  • Author(s): Toyota M
  • Organizer: IPSR symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 高感度バイオセンサーを用いた植物の構造力学的研究 (2019)
  • Author(s): 豊田正嗣
  • Organizer: 日本植物生理学会
  • Invited
• [Presentation] Long-distance rapid Ca2+ and electrical signals in Mimosa pudica (2019)
  • Author(s): Hagihara T, Miura T, Mano H, Hasebe M, Toyota M
  • Organizer: Japan-Taiwan Plant Biology 2019
  • Int'l Joint Research / Invited