顕微技術を駆使した計測と制御による細胞構造のしなやかさの高精度解析

• Project Area: Elucidation of the strategies of mechanical optimization in plants toward the establishment of the bases for sustainable structure system
• Project/Area Number: 18H05493
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 細川 陽一郎 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (20448088)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安國 良平 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (40620612) ; 三村 徹郎 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任研究員 (20174120)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥72,020,000 (Direct Cost: ¥55,400,000、Indirect Cost: ¥16,620,000); Fiscal Year 2022: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2021: ¥14,820,000 (Direct Cost: ¥11,400,000、Indirect Cost: ¥3,420,000); Fiscal Year 2020: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2019: ¥14,820,000 (Direct Cost: ¥11,400,000、Indirect Cost: ¥3,420,000); Fiscal Year 2018: ¥12,480,000 (Direct Cost: ¥9,600,000、Indirect Cost: ¥2,880,000)
• Keywords: 原子間力顕微鏡 / フェムト秒レーザー / フォースマッピング / 顕微細胞操作 / 液胞制御 / 原子間力顕 / 原子間力顕微

Outline of Annual Research Achievements

原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、AFM探針に作用させた力に対する細胞壁のへこみ（フォースカーブ）を、細胞上でマッピングできるシステムを立ち上げ、植物細胞の堅さの評価方法の確立を進めている。これまで植物細胞の解析に、均一なバルク材料を仮定したヘルツの接触理論が慣習的に多くの場合に適用されているが、この解析モデルでは、植物細胞の硬さを正確に表現できないことが示されている。植物細胞はバルク材料ではなく、細胞壁からなる密閉型の箱を膨圧による細胞内圧により支えられる構造であり、植物細胞の外力による作用（外力に対する構造の安定性と不安定性）は、この構造により決定されている。このような構造は、建築学においてシェル構造と呼ばれ、その学理が構築されており、川口班らの知見に基づき、出村班・津川が理論構築をすすめ、有限用法を用いたシミュレーションも駆使し、植物細胞に特化したシェル構造モデルの構築を進めている。植物細胞の外力による作用は、細胞壁の弾性応力（E）と、膨圧による細胞内圧（P）が、細胞の構造と合わさって決定される細胞壁の張力（T）により決定される。これらのパラメーターは、フォースカーブの計測のみでは決定できず、細胞壁の形状（トポグラフィー像）と、レーザーを照射してPを緩和させた後のフォースカーブとトポグラフィー像を合わせて解析することで、評価しようとしている。さらに、シャジクモを用いたマクロとミクロを比較する実験、シャジクモとシロイヌナズナの細胞表面を片持ち梁状に加工してAFM測定することにより、PとTに依存しないEを直接評価する方法を確立し、植物細胞の硬さとしなやかさの本質に迫っていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

AFM 探針を植物細胞表面に押し付けていき、押し付け量と探針の曲がり量の相関曲線（フォースカーブ）を得ることで、植物細胞の弾性と塑性を調べることができる。このとき、探針の位置を細胞表面で移動させていき、フォースカーブを得れば、細胞表面の弾性と塑性の空間分布をマッピング（フォースマッピング）することが可能である。この細胞表面の弾性と塑性には、細胞壁の弾性と塑性、細胞内の膨圧が強い影響を及ぼしていると考えられるが、その実態はほとんど分かっていない。これまでの研究において、AFMによるフォースカーブ測定に加え、プレッシャープローブによる細胞内圧の評価、シャジクモを用いたマクロスケールでの植物細胞の弾性率の評価をおこない、植物細胞に対して、均一な固体材料を解析するヘルツモデルによる弾性率評価が適用できないことが明らかになった。これらの結果を、出村班、川口班と共同して検討し、硬い細胞壁が細胞内圧（膨圧）により支えられる植物細胞特有の構造を、建築学に基づいた理論（シェル理論）による力学モデルにより理解することが妥当であるとの見解に至った。

Strategy for Future Research Activity

構築された理論モデルの妥当性を証明するためのAFMとプレッシャープローブを用いた実験を推進している。シャジクモを用いた実験で、マクロスケールで高精度に細胞壁の弾性率や細胞内圧のデータを取得することが可能になっている。今後、シャジクモにフェムト秒レーザーによる加工を適用し、シロイヌナズナなどの通常の植物細胞と同程度となるスケールとみなしてその弾性率を評価できる加工を施し、AFMによるフォースカーブ計測を適用し、マクロスケールとミクロスケールの植物細胞壁の弾性率や張力の計測データを照合する。この結果にもとづき、マクロスケールの評価が不可能であるシロイヌナズナの細胞に対しても、レーザー加工を施し、シャジクモと同等の評価をおこない、比較検討することにより、通常の植物細胞に対して成り立つマクロな観点からの理解につなげ、建築学に基づく理論との整合性についての検証を進める。さらに、シロイヌナズナの根、茎、葉などの部位やその組織内での細胞構造や弾性率の違いについて、AFMを用いたデータ取得を進めていき、植物全体で成立している力学とそれが進化の中で如何に最適化されてきたかについて迫りたいと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Hydrodynamic particle focusing enhanced by femtosecond laser deep grooving at low Reynolds numbers (2021)
  • Author(s): Zhang Tianlong、Namoto Misuzu、Okano Kazunori、Akita Eri、Teranishi Norihiro、Tang Tao、Anggraini Dian、Hao Yansheng、Tanaka Yo、Inglis David、Yalikun Yaxiaer、Li Ming、Hosokawa Yoichiroh
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 1652-1652
  • DOI: 10.1038/s41598-021-81190-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] In situ measurement of cell stiffness of Arabidopsis roots growing on a glass micropillar support by atomic force microscopy (2020)
  • Author(s): Akita Eri、Yalikun Yaxiaer、Okano Kazunori、Yamasaki Yuki、Ohtani Misato、Tanaka Yo、Demura Taku、Hosokawa Yoichiroh
  • Journal Title: Plant Biotechnology Volume: 37 Issue: 4 Pages: 417-422
  • DOI: 10.5511/plantbiotechnology.20.1016a
  • NAID: 130007960233
  • ISSN: 1342-4580, 1347-6114
  • Year and Date: 2020-12-25
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hechtian Strands Transmit Cell Wall Integrity Signals in Plant Cells (2020)
  • Author(s): Yoneda Arata、Ohtani Misato、Katagiri Daisuke、Hosokawa Yoichiroh、Demura Taku
  • Journal Title: Plants Volume: 9 Issue: 5 Pages: 604-604
  • DOI: 10.3390/plants9050604
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Photoinjection of fluorescent nanoparticles into intact plant cells using femtosecond laser amplifier (2020)
  • Author(s): Rukmana Taufiq Indra、Moran Gabriela、Meallet-Renault Rachel、Clavier Gilles、Kunieda Tadashi、Ohtani Misato、Demura Taku、Yasukuni Ryohei、Hosokawa Yoichiroh
  • Journal Title: APL Photonics Volume: 5 Issue: 6 Pages: 066104-066104
  • DOI: 10.1063/5.0001687
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Direct observation of nanoparticle diffusion in cytoplasm of single plant cells realized by photoinjection with femtosecond laser amplifier (2020)
  • Author(s): Rukmana Taufiq Indra、Yasukuni Ryohei、Moran Gabriela、Meallet-Renault Rachel、Clavier Gilles、Kunieda Tadashi、Ohtani Misato、Demura Taku、Hosokawa Yoichiroh
  • Journal Title: Applied Physics Express Volume: 13 Issue: 11 Pages: 117002-117002
  • DOI: 10.35848/1882-0786/abc490
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications (2020)
  • Author(s): Hao Yansheng、Cheng Shaokoon、Tanaka Yo、Hosokawa Yoichiroh、Yalikun Yaxiaer、Li Ming
  • Journal Title: Biotechnology Advances Volume: 45 Pages: 107648-107648
  • DOI: 10.1016/j.biotechadv.2020.107648
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Selective induction of targeted cell death and elimination by near-infrared femtosecond laser ablation (2020)
  • Author(s): Okano Kazunori、Wang Chung-Han、Hong Zhen-Yi、Hosokawa Yoichiroh、Liau Ian
  • Journal Title: Biochemistry and Biophysics Reports Volume: 24 Pages: 100818-100818
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2020.100818
  • NAID: 120006959887
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Calcium dynamics during trap closure visualized in transgenic Venus flytrap (2020)
  • Author(s): Suda Hiraku、Mano Hiroaki、Toyota Masatsugu、Fukushima Kenji、Mimura Tetsuro、Tsutsui Izuo、Hedrich Rainer、Tamada Yosuke、Hasebe Mitsuyasu
  • Journal Title: Nature Plants Volume: 6 Issue: 10 Pages: 1219-1224
  • DOI: 10.1038/s41477-020-00773-1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Visualization of seasonal shifts of phosphorus re-translocation and overwintering recycling in a shortened annual cycle system of the deciduous poplar tree (Populus alba L.) (2020)
  • Author(s): Kurita Yuko、Kanno Satomi、Sugita Ryohei、Hirose Atsushi、Ohnishi Miwa、Ishizaki Kimitsune、Fukaki Hidehiro、Tanoi Keitaro、Nakanishi Tomoko M.、Baba Kei’ichi、Mimura Tetsuro
  • Journal Title: BioRxiv Volume: 10.1101
  • DOI: 10.1101/2020.04.12.038562
• [Journal Article] Single-cell metabolome analysis in plants (2020)
  • Author(s): 山本 浩太郎、三村 徹郎
  • Journal Title: Regulation of Plant Growth & Development Volume: 55 Issue: 2 Pages: 100-104
  • DOI: 10.18978/jscrp.55.2_100
  • NAID: 130008131350
  • ISSN: 1346-5406, 2189-6305
• [Journal Article] High-speed micro-particle manipulation in a microfluidic chip by directional femtosecond laser impulse (2019)
  • Author(s): Zhen-Yi Hong, Kazunori Okano, Dino Di Carlo, Katsunori Tanaka, Yaxiaer Yalikun and Yoichiroh Hosokawa
  • Journal Title: Sensors and Actuators A: Physical Volume: 297 Pages: 111566-111566
  • DOI: 10.1016/j.sna.2019.111566
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Applications of femtosecond laser-induced impulse to cell research (2019)
  • Author(s): Yoichiroh Hosokawa
  • Journal Title: JJAP invited review Volume: Vol.58, No.11 Issue: 11 Pages: 110102-110102
  • DOI: 10.7567/1347-4065/ab4749
  • NAID: 210000157177
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Enzyme-Assisted Photoinjection of Megadalton Molecules into Intact Plant Cells Using Femtosecond Laser Amplifier (2019)
  • Author(s): Taufiq Indra Rukmana, Gabriela Moran, Rachel Meallet-Renault, Misato Ohtani, Taku Demura
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 17530-17530
  • DOI: 10.1038/s41598-019-54124-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] フェムト秒レーザーを用いたTobacco BY植物細胞への巨大高分子導入 (2019)
  • Author(s): 安國 良平, Rukmana Taufiq Indra, 大谷 美沙都, 出村 拓, 細川 陽一郎
  • Journal Title: 光・量子デバイス研究会資料 Volume: - Pages: 17-19
• [Presentation] 超短パルスレーザーが拓く単一細胞の操作・計測技術 (2021)
  • Author(s): 細川陽一郎
  • Organizer: レーザー学会学術講演会第41回年次大会
  • Invited
• [Presentation] Dynamics of vacuolar function in plant cell (2021)
  • Author(s): Tetsuro Mimura
  • Organizer: Lecture on Plant Cell Biology and Physiology at Department of Agronomy and Horticulture, Faculty of Agriculture IPB University, Bogor, Indonesia
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single cell manipulations utilizing femtosecond laser impulse and the physics (2020)
  • Author(s): 細川陽一郎
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] マイクロデバイス上でのAFM計測による成長する植物細胞の力学状態の評価 (2020)
  • Author(s): 秋田絵理
  • Organizer: 日本植物学会第84回大会
  • Invited
• [Presentation] フェムト秒レーザー誘起衝撃力を利用した細胞間の力学相互作用の解明 (2020)
  • Author(s): 細川陽一郎
  • Organizer: レーザー学会学術講演会第40回年次大会
  • Invited
• [Presentation] フェムト秒レーザーと原子間力顕微鏡を用いた単一植物細胞の力学計測 (2020)
  • Author(s): 竹林竜，秋田絵里，岡野和宣，安國良平，細川陽一郎
  • Organizer: レーザー学会学術講演会第40回年次大会
• [Presentation] フェムト秒レーザーを用いた植物細胞へのナノ粒子導入 (2020)
  • Author(s): 安國良平
  • Organizer: レーザー学会学術講演会第40回年次大会
  • Invited
• [Presentation] 顕微技術を駆使した計測と制御による細胞構造のしなやかさの高精度解析 (2019)
  • Author(s): 細川陽一郎
  • Organizer: 新学術領域研究「植物構造オプト」第2回班会議
  • Invited
• [Presentation] Femtosecond laser photoporation of fluorogenic peptide aptamers for highly sensitive imaging of polysaccharides in Euglena gracilis (2019)
  • Author(s): Takanori Maeno, Takanori Uzawa, Izumi Kono, Kazunori Okano, Takanori Iino, Taro Ogawa, Osamu Iwata, Takuro Ito, Kengo Suzuki, Keisuke Goda, Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: The 8th International Congress on Laser Advanced Materials Processing
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Acoustic cell arrangement in micro-fluidic chip for cells sorting by femtosecond laser-induced impulsive force (2019)
  • Author(s): Yusuke Ajikawa, Tomoyuki Suzuki, Yalikun Yaxiaer, Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: M&BE2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Particle Arrangement in Microfluidic Chip by Additive Femtosecond Laser Processing in the Channel (2019)
  • Author(s): Y. Yalikun, Z. Tianlong, C. Fang, M. Namoto, Y. Hosokawa
  • Organizer: 15th International Conference on Laser Ablation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Femtosecond Laser-induced Impulsive Force in Applications for Cell Research (2019)
  • Author(s): Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
  • Invited
• [Presentation] A Transparent Flow Velocity Sensor of Ultra-thin Glass Sheet Fabricated by Femtosecond Laser Processing (2019)
  • Author(s): Yansheng Hao, Chaoying Fang, Ming Li, Yaxiaer Yalikun, Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
• [Presentation] Femtosecond Laser-processed Pattern on Glass Substrate for Focusing Microparticles in Fluid (2019)
  • Author(s): Tianlong Zhang, Misuzu Namoto, Chaoying Fang, Ming Li, Yalikun Yaxiaer, and Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
• [Presentation] ガラス製マイクロデバイスを用いた植物組織のAFM力学計測 (2019)
  • Author(s): 秋田絵理, 竹林竜, 岡野和宣, Yalikun Yaxiaer, 岸田佳祐, 國枝正, 出村拓, 澤進一郎, 細川陽一郎
  • Organizer: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
• [Presentation] 原子間力顕微鏡とフェムト秒レーザーを用いた細胞組織の力学特性解析 (2019)
  • Author(s): 竹林竜，秋田絵理，岡野和宣，安國良平，細川陽一郎
  • Organizer: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
• [Presentation] Photoinjection of Flourescence Nanoparticles into Plant Cells Using Femtosecond Laser Amplifier with Additional Enzyme Treatment (2019)
  • Author(s): Taufiq Indra Rukmana, Gabriela Moran, Rachel Meallet-Renault, Misato Ohtani,Taku Demura, Ryohei Yasukuni, Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: 第80回応用物理学会秋季学術講演会
• [Presentation] VND7木部道管細胞誘導系を用いたシロイヌナズナの二次細胞壁パターン形成制御の解析 (2019)
  • Author(s): 岸田 佳祐, 國枝 正, 津川 暁 , 細川 陽一郎 , 出村 拓
  • Organizer: 日本植物学会第83回大会
• [Presentation] AFM力学計測のための新規ガラスマイクロデバイスの開発 (2019)
  • Author(s): 秋田絵理, 竹林竜, 岡野和宣, Yalikun Yaxiaer, 岸田佳祐, 國枝正, 大谷美沙都,出村拓, 澤進一郎, 細川陽一郎
  • Organizer: 植物構造オプト第1回若手の会
• [Presentation] フェムト秒レーザーアブレーション法とAFMを組み合わせた単一植物細胞の力学計測装置の開発 (2019)
  • Author(s): 竹林竜，秋田絵理，岡野和宣，細川陽一郎
  • Organizer: 植物構造オプト第1回若手の会
• [Presentation] フェムト秒レーザーを用いた単一植物細胞への巨大分子導入 (2019)
  • Author(s): 上田勇真, Taufiq Indra Rukmana, 岡野和宣, 安國良平, 細川陽一郎, 出村拓, 大谷美沙都
  • Organizer: 植物構造オプト第1回若手の会
• [Presentation] マイクロデバイス中でのフェムト秒レーザー誘起衝撃力の数値解析 (2019)
  • Author(s): 山本将也, 阿路川雄介, 寺西教裕, 安國良平, 細川陽一郎
  • Organizer: 植物構造オプト第1回若手の会
• [Presentation] シロイヌナズナ木部道管細胞誘導系によって形成される二次細胞壁の力学的解析 (2019)
  • Author(s): 岸田佳祐、國枝正、津川暁、秋田絵理、岡野和宣、細川陽一郎、出村拓
  • Organizer: 植物構造オプト第1回若手の会
• [Presentation] AFM Force Measurement of Arabidopsis Utilizing Femtosecond Laser Processing and Glass Micro-Device (2019)
  • Author(s): 細川陽一郎
  • Organizer: 熊本大学ミニシンポ "Strategies of mechanical optimization in plants "
  • Invited
• [Presentation] Imaging of elasticity of Arabidopsis root cells by atomic force microscopy (2019)
  • Author(s): Ryu Takebayashi, Eri Akita, Kazunori Okano, Ryohei Yasukuni, Misato Ohtani, Taku Demura and Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: 陽明大学セミナー
• [Presentation] Force mapping of Arabidopsis root cells by atomic force microscop (2019)
  • Author(s): Ryu Takebayashi, Eri Akita, Kazunori Okano, Ryohei Yasukuni, Misato Ohtani, Taku Demura and Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: 2019 Annual Meeting of the Physical Society of Taiwan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 原子間力顕微鏡による植物細胞表面の弾性分布の観察 (2019)
  • Author(s): 竹林 竜, 秋田 絵里, 岡野 和宣, 安國 良平, 大谷 美沙都, 出村 拓, 細川 陽一郎
  • Organizer: 応用物理学会関西支部 平成30年度第3回支部講演会
• [Presentation] フェムト秒レーザーを用いたTobacco BY植物細胞への巨大高分子導入 (2019)
  • Author(s): 安國 良平, Rukmana Taufiq Indra, 大谷 美沙都, 出村 拓, 細川 陽一郎
  • Organizer: 光・量子デバイス研究会
• [Presentation] Detection and manipulation of single plant cells by fs laser and AFM (2019)
  • Author(s): Yoichiroh Hosokawa
  • Organizer: ISMO-NAIST Symposium