Decryption of the ubiquitin code by chemo-technologies and advanced proteomics

• Project Area: New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies
• Project/Area Number: 18H05498
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, プロジェクトリーダー (80462779)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大竹 史明 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 特任准教授 (60447373)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥131,430,000 (Direct Cost: ¥101,100,000、Indirect Cost: ¥30,330,000); Fiscal Year 2022: ¥28,860,000 (Direct Cost: ¥22,200,000、Indirect Cost: ¥6,660,000); Fiscal Year 2021: ¥28,860,000 (Direct Cost: ¥22,200,000、Indirect Cost: ¥6,660,000); Fiscal Year 2020: ¥28,860,000 (Direct Cost: ¥22,200,000、Indirect Cost: ¥6,660,000); Fiscal Year 2019: ¥28,860,000 (Direct Cost: ¥22,200,000、Indirect Cost: ¥6,660,000); Fiscal Year 2018: ¥15,990,000 (Direct Cost: ¥12,300,000、Indirect Cost: ¥3,690,000)
• Keywords: ユビキチン / プロテアソーム / p97 / ケモテクノロジー / 質量分析 / 質量分析計

Outline of Annual Research Achievements

本計画研究では、ユビキチン解析に特化した様々な最先端プロテオミクス解析法を確立し、領域内で開発するケモテクノロジーを利用して、ユビキチンシグナルの根幹である「ユビキチン修飾の高次構造」の直接の解析と「デコーダー分子による識別・解読機構」の解明を目的とする。
１．最先端ユビキチン・プロテオミクス解析法の開発（佐伯・大竹）：高深度比較プロテオーム解析法（TMT16plex/FAIMS/MS2）により、内藤班と共同でサリドマイドの副作用である血管新生阻害に関与するネオ基質を同定した。また、造血器型プロスタグランジンD合成酵素を標的としたPROTACの選択性を評価し、同PROTACの特異性が非常に高いことを明らかにした。また、林班と共同で、ユビキチン単量体に対する人工抗体（モノボディ）を取得し、従来の抗ユビキチン抗体より高親和性であること、ユビキチン化基質のプロテオミクス解析に有用であることを示した。
2．エステル連結型ユビキチン鎖の機能解析（佐伯）：鳴海班と共同で、新しいユビキチン鎖であるSer20連結型ユビキチン鎖を化学合成し、Ser20Ub鎖を認識するタンパク質をMS解析により同定した。
３．シャトル分子の機能解析および阻害剤開発（佐伯）：低濃度ホルマリン架橋とユビキチン・プロテオミクス解析を組み合わせ、RAD23Bが細胞内で認識するユビキチン化基質を網羅的に同定することに成功した。また、林班と共同でRAD23Bの機能を阻害する人工抗体のスクリーニングを開始した。
４．分岐型ユビキチン鎖形成酵素の同定（大竹）：VHL型PROTACのネオ基質にはK29/K48分岐鎖が付加されることを見出し、TRIP12がK29鎖を生成するユビキチンリガーゼであること、分岐鎖形成によりネオ基質の分解誘導が増強することを見出した（Mol Cell 2021）。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

前年度までに確立した高深度比較プロテオーム解析や分岐型ユビキチン鎖の高次構造解析法を標的タンパク質分解誘導剤の解析に用いることで、サリドマイド副作用に関係するネオ基質同定やPROTAC（H-PGDS）の特異性評価、さらにVHL型PROTAC作用を増強するユビキチンリガーゼTRIP12の発見など、研究に大きな進捗がみられた。また、ケモテクノロジーを用いたユビキチンコード研究についても研究が順調に進展しており、ユビキチンやデコーダー分子RAD23Bに対する人工抗体の開発、化学合成エステル型ユビキチン鎖を用いた新規デコーダー分子候補の同定などに成功しつつある。特に、K29/K48分岐型ユビキチン鎖形成によるPROTACネオ基質の分解増強についてはMol Cell誌に発表し大きな反響を得ている。このように、本年度も当初の計画以上に研究が進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

１．最先端ユビキチン・プロテオミクス解析法の開発：質量分析を用いた高深度比較プロテオーム解析法（TMT16plex/FAIMS/MS2）および前年度までに確立したユビキチン化基質の網羅的変動解析法により、研究領域内で開発された新型PROTACの選択性や作用機序をプロテオーム変動を指標として評価する（佐伯）。また、分岐型ユビキチン鎖の組成解析（Middle-down MS2）について、岡本班が開発した化学合成ユビキチンを内部標準とした絶対定量法を引き続き開発する（大竹）。これらの新しい解析技術と従来のユビキチン鎖絶対定量法を用いて、領域内の各種共同研究を実施する（佐伯・大竹）。
2．プロテアソーム経路のユビキチンデコーダー分子の機能解析：これまでユビキチン選択的シャペロンp97-UFD1-NPL4とシャトル分子がプロテアソーム基質の選別とプロテアソームへの運搬に重要であることを見出しており、上記の最先端ユビキチン・プロテオーム解析法を用いて、基質選択性、ユビキチン鎖タイプ選択性を解明する（佐伯）。また、p97のユビキチン結合コファクターUFD1-NPL4、シャトル分子RAD23A、B、UBQLNファミリーについて機能を喪失させる化学ツールを領域内で開発する（佐伯）。
３．ユビキチンリガーゼの低分子リガンド開発：研究領域内で取得されたユビキチンリガーゼ新規低分子化合物リガンドを試験管内ユビキチン化反応により評価する（佐伯）。
４．新規ユビキチンコードの機能解析：研究領域内で取得された化学合成ユビキチン鎖を用いて、質量分析を用いたデコーダー分子の探索および機能解析を実施する（佐伯）。
５．分岐型ユビキチン鎖の機能解析：分岐型ユビキチン鎖によるPROTAC増強効果の普遍性を明らかにするとともに、分岐鎖形成に関与するユビキチンリガーゼをさらに探索する（大竹）。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Max Planck Institute of Biochemistry(ドイツ)
  • Country Name: GERMANY
  • Counterpart Institution: Max Planck Institute of Biochemistry
• [Journal Article] MIND bomb 2 prevents RIPK1 kinase activity-dependent and -independent apoptosis through ubiquitylation of cFLIPL (2021)
  • Author(s): Nakabayashi Osamu、Takahashi Hirotaka、Moriwaki Kenta、Komazawa-Sakon Sachiko、Ohtake Fumiaki、Murai Shin、Tsuchiya Yuichi、Koyahara Yuki、Saeki Yasushi、Yoshida Yukiko、Yamazaki Soh、Tokunaga Fuminori、Sawasaki Tatsuya、Nakano Hiroyasu
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Pages: 80
  • DOI: 10.1038/s42003-020-01603-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] TRIP12 promotes small-molecule-induced degradation through K29/K48-branched ubiquitin chains (2021)
  • Author(s): Kaiho-Soma Ai、Akizuki Yoshino、Igarashi Katsuhide、Endo Akinori、Shoda Takuji、Kawase Yasuko、Demizu Yosuke、Naito Mikihiko、Saeki Yasushi、Tanaka Keiji、Ohtake Fumiaki
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 81 Pages: 1411～1424.e7
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.01.023
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular bases for HOIPINs-mediated inhibition of LUBAC and innate immune responses (2020)
  • Author(s): Oikawa Daisuke、Sato Yusuke、Ohtake Fumiaki、Komakura Keidai、Hanada Kazuki、Sugawara Koji、Terawaki Seigo、Mizukami Yukari、Phuong Hoang T.、Iio Kiyosei、Obika Shingo、Fukushi Masaya、Irie Takashi、Tsuruta Daisuke、Sakamoto Shinji、Tanaka Keiji、Saeki Yasushi、Fukai Shuya、Tokunaga Fuminori
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 3 Pages: 163
  • DOI: 10.1038/s42003-020-0882-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The HOIL-1L ligase modulates immune signalling and cell death via monoubiquitination of LUBAC (2020)
  • Author(s): Fuseya Yasuhiro、Fujita Hiroaki、Kim Minsoo、Ohtake Fumiaki、Nishide Akira、Sasaki Katsuhiro、Saeki Yasushi、Tanaka Keiji、Takahashi Ryosuke、Iwai Kazuhiro
  • Journal Title: Nature Cell Biology Volume: 22 Pages: 663～673
  • DOI: 10.1038/s41556-020-0517-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] α-synuclein strains that cause distinct pathologies differentially inhibit proteasome (2020)
  • Author(s): Suzuki Genjiro、Imura Sei、Hosokawa Masato、Katsumata Ryu、Nonaka Takashi、Hisanaga Shin-Ichi、Saeki Yasushi、Hasegawa Masato
  • Journal Title: eLife Volume: 9 Pages: e56825
  • DOI: 10.7554/eLife.56825
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A substrate-trapping strategy to find E3 ubiquitin ligase substrates identifies Parkin and TRIM28 targets (2020)
  • Author(s): Watanabe Masashi、Saeki Yasushi、Takahashi Hidehisa、Ohtake Fumiaki、Yoshida Yukiko、Kasuga Yusuke、Kondo Takeshi、Yaguchi Hiroaki、Suzuki Masanobu、Ishida Hiroki、Tanaka Keiji、Hatakeyama Shigetsugu
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 3 Pages: 592
  • DOI: 10.1038/s42003-020-01328-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ribosomal protein S7 ubiquitination during ER stress in yeast is associated with selective mRNA translation and stress outcome (2020)
  • Author(s): Matsuki Yasuko、Matsuo Yoshitaka、Nakano Yu、Iwasaki Shintaro、Yoko Hideyuki、Udagawa Tsuyoshi、Li Sihan、Saeki Yasushi、Yoshihisa Tohru、Tanaka Keiji、Ingolia Nicholas T.、Inada Toshifumi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Pages: 19669
  • DOI: 10.1038/s41598-020-76239-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Multi-Step Ubiquitin Decoding Mechanism for Proteasomal Degradation (2020)
  • Author(s): Tsuchiya Hikaru、Endo Akinori、Saeki Yasushi
  • Journal Title: Pharmaceuticals Volume: 13 Pages: 128～128
  • DOI: 10.3390/ph13060128
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mass Spectrometry Technologies for Deciphering the Ubiquitin Code (2020)
  • Author(s): Ohtake Fumiaki
  • Journal Title: Trends in Biochemical Sciences Volume: 45 Pages: 820～821
  • DOI: 10.1016/j.tibs.2020.04.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ストレスとユビキチンに依存したプロテアソームの液?液相分離 (2020)
  • Author(s): 佐伯 泰、安田 さや香、土屋 光
  • Journal Title: 生化学 Volume: 92 Pages: 822～826
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2020.920822
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stress- and ubiquitylation-dependent phase separation of the proteasome (2020)
  • Author(s): Yasuda Sayaka、Tsuchiya Hikaru、Kaiho Ai、Guo Qiang、Ikeuchi Ken、Endo Akinori、Arai Naoko、Ohtake Fumiaki、Murata Shigeo、Inada Toshifumi、Baumeister Wolfgang、Fernandez-Busnadiego Ruben、Tanaka Keiji、Saeki Yasushi
  • Journal Title: Nature Volume: 578 Pages: 296～300
  • DOI: 10.1038/s41586-020-1982-9
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Two distinct modes of DNMT1 recruitment ensure stable maintenance DNA methylation (2020)
  • Author(s): Nishiyama Atsuya、Mulholland Christopher B.、Bultmann Sebastian、Kori Satomi、Endo Akinori、Saeki Yasushi、Qin Weihua、Trummer Carina、Chiba Yoshie、Yokoyama Haruka、Kumamoto Soichiro、Kawakami Toru、Hojo Hironobu、Nagae Genta、Aburatani Hiroyuki、Tanaka Keiji、Arita Kyohei、Leonhardt Heinrich、Nakanishi Makoto
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 11 Pages: 1222
  • DOI: 10.1038/s41467-020-15006-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RQT complex dissociates ribosomes collided on endogenous RQC substrate SDD1 (2020)
  • Author(s): Matsuo Yoshitaka、Tesina Petr、Nakajima Shizuka、Mizuno Masato、Endo Akinori、Buschauer Robert、Cheng Jingdong、Shounai Okuto、Ikeuchi Ken、Saeki Yasushi、Becker Thomas、Beckmann Roland、Inada Toshifumi
  • Journal Title: Nature Structural & Molecular Biology Volume: 27 Pages: 323～332
  • DOI: 10.1038/s41594-020-0393-9
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 最先端プロテオミクス解析を用いたユビキチン研究 (2020)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Journal Title: ファルマシア Volume: 56 Pages: 21～25
  • DOI: 10.14894/faruawpsj.56.1_21
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 細胞内のユビキチン鎖長解析 (2020)
  • Author(s): 土屋 光、佐伯 泰
  • Journal Title: 生化学 Volume: 92 Pages: 14～19
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2020.920014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 分岐型ユビキチン鎖とアセチル化ユビキチン (2020)
  • Author(s): 大竹 史明
  • Journal Title: 生化学 Volume: 92 Pages: 57～63
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2020.920057
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stepwise multipolyubiquitination of p53 by the E6AP-E6 ubiquitin ligase complex (2019)
  • Author(s): Masuda Yuji、Saeki Yasushi、Arai Naoko、Kawai Hidehiko、Kukimoto Iwao、Tanaka Keiji、Masutani Chikahide
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 294 Pages: 14860～14875
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.008374
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural insights into ubiquitin recognition and Ufd1 interaction of Npl4 (2019)
  • Author(s): Sato Yusuke、Tsuchiya Hikaru、Yamagata Atsushi、Okatsu Kei、Tanaka Keiji、Saeki Yasushi、Fukai Shuya
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 10 Pages: 5708
  • DOI: 10.1038/s41467-019-13697-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Collided ribosomes form a unique structural interface to induce Hel2-driven quality control pathways. (2019)
  • Author(s): Ikeuchi, K., Tesina, P., Matsuo, Y., Sugiyama, T., Cheng, J., Saeki, Y., Tanaka, T., Becker, T., Beckmann, R., and Inada, T.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 38 Pages: e100276
  • DOI: 10.15252/embj.2018100276
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Methods to measure ubiquitin chain length and linkage. (2019)
  • Author(s): Ohtake, F., Tsuchiya, H., Tanaka, K., and Saeki, Y.
  • Journal Title: Methods Enzymol. Volume: 618 Pages: 105-133
  • DOI: 10.1016/bs.mie.2018.12.019
• [Journal Article] TR-TUBE system: Method for detecting ubiquitination activity and identifying ubiquitinated substrates. (2019)
  • Author(s): Yoshida, Y., Saeki, Y., Tsuchiya, H., and Tanaka, K.
  • Journal Title: Methods Enzymol. Volume: 618 Pages: 135-147
  • DOI: 10.1016/bs.mie.2018.12.019
• [Journal Article] Deubiquitylases USP5 and USP13 are recruited to and regulate heat-induced stress granules through deubiquitylating activities. (2018)
  • Author(s): Xie, X., Matsumoto, S., Endo, A., Fukushima, T., Kawahara, H., Saeki, Y., and Komada, M.
  • Journal Title: J. Cell. Sci. Volume: 131 Pages: jcs210856
  • DOI: 10.1242/jcs.210856
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] HERC2 facilitates BLM and WRN helicase complex interaction with RPA to suppress G-quadruplex DNA. (2018)
  • Author(s): Wu, W., Rokutanda, N., Takeuchi, J., Lai, Y., Maruyama, R., Togashi, Y., Nishikawa, H., Arai, N., Miyoshi, Y., Suzuki, N., Saeki, Y., Tanaka, K., and Ohta, T.
  • Journal Title: Cancer Res. Volume: 78 Pages: 6371-6385
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-1877
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Specific modification of aged proteasomes revealed by tag-exchangeable knock-in mice. (2018)
  • Author(s): Tomita, T., Hirayama, S., Sakurai, Y., Ohte, Y., Yoshihara, H., Saeki, Y., Hamazaki, J., and Murata, S.
  • Journal Title: Mol. Cell Biol. Volume: 39 Pages: e00426-18
  • DOI: 10.1128/MCB.00426-18
  • Peer Reviewed
• [Presentation] プロテオミクス解析から明らかになるユビキチン修飾のバイオロジー (2020)
  • Author(s): 大竹史明
  • Organizer: 日本質量分析学会第68回質量分析総合討論会
  • Invited
• [Presentation] Role of ubiquitin chain architecture revealed by chemo-technology (2020)
  • Author(s): Fumiaki Ohtake
  • Organizer: 第93回日本生化学会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] RAD23B drives polyubiquitin chain-dependent phase separation of the proteasome (2020)
  • Author(s): Akinori Endo、Hikaru Tsuchiya、Keiji Tanaka, Yasushi Saeki
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] ユビキチン研究の新展開：ケミカルバイオロジーとの融合から相分離まで (2020)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 日本化学会第100春季年会
  • Invited
• [Presentation] ケモテクノロジーと質量分析計を活用したユビキチンコードの解読 (2019)
  • Author(s): 佐伯 泰、遠藤彬則、土屋 光、大竹史明
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会 第14回年会
  • Invited
• [Presentation] ユビキチン研究の新展開―相分離から分解誘導剤まで (2019)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 第19回 日本蛋白質科学会年会・第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
  • Invited
• [Presentation] Orbitrap Fusion Lumosを使った革新的ユビキチン研究 (2019)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: サーモフィッシャーサイエンティフィック 質量分析フォーラム2019
  • Invited
• [Presentation] ユビキチンによるタンパク質分解のしくみ：We will degrade you! (2019)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 第9回CSJ化学フェスタ
  • Invited
• [Presentation] MSを用いたユビキチンシグナルの網羅的解析 (2019)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 第11回 LC/MSワークショップ
  • Invited
• [Presentation] 高浸透圧ストレスによるプロテアソーム液滴形成と核内タンパク質分解 (2019)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 第14回日本臨床ストレス応答学会
  • Invited
• [Presentation] Stress- and ubiquitylation-dependent phase separation of the proteasome (2019)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: 42nd MBSJ, Symposium ”Frontiers of in-cell protein sciences”
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 質量分析技術とケミカルツールでユビキチン鎖の複雑性に挑む (2019)
  • Author(s): 大竹史明
  • Organizer: 第4回先端ケミカルバイオロジー研究会
  • Invited
• [Presentation] Ub-ProT reveals global length and composition of protein ubiquitylation in cells. (2018)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: The 8th Proteasome and Autophagy Congress
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Cdc48-Rad23/Dsk2 Axis Contributes to K48 Ubiquitin Chain Specificity of the Proteasome. (2018)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: FASEB SRC “Ubiquitin and Cellular Regulation”
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Ubiquitin-dependent phase separation for proteasomal degradation. (2018)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: International Symposium on “Proteins; from the Cradle to the Grave”
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The NEDD4 family ubiquitin ligase ITCH regulates proteasomal degradation by seeding branched ubiquitin chains. (2018)
  • Author(s): Fumiaki Ohtake, Yasushi Saeki, and Keiji Tanaka
  • Organizer: FASEB Conference ”Ubiquitin and cellular regulation”
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Post-translational modification code of ubiquitin in signal transduction and protein degradation (2018)
  • Author(s): Fumiaki Ohtake, Yasushi Saeki, and Keiji Tanaka
  • Organizer: 第91回日本生化学会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] The ubiquitin ligases ITCH and UBR5 regulate proteasomal degradation through K48/K63 branched ubiquitin chains. (2018)
  • Author(s): Ohtake, F., Saeki, Y., and Tanaka, K.
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会シンポジウム
  • Invited
• [Book] イメージング時代の構造生命科学 (2020)
  • Author(s): 安田さや香、田中啓二、佐伯 泰
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 羊土社
  • ISBN: 978-4-7581-0385-5
• [Remarks] 新学術領域研究「ケモテクノロジーが拓くユビキチンニューフロンティア」ホームページ
  • URL: http://ubiquitin.jp/index.html
• [Remarks] 公益財団法人東京都医学総合研究所蛋白質代謝研究室ホームページ
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/pro-meta/
• [Remarks] 東京大学大学院新領域創成科学研究科メディカル情報生命専攻ホームページ
  • URL: http://www.cbms.k.u-tokyo.ac.jp/lab/rinsho.html#saeki
• [Remarks] プレスリリース「標的タンパク質分解誘導剤の効果を促進する酵素を発見」
  • URL: https://www.hoshi.ac.jp/site/information/wp-content/uploads/2021/02/802f10a59ff7ef0a252fdb8c13a53c51.pdf
• [Remarks] 液－液相分離が担う核内タンパク質分解機構の発見
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2020/0205.html
• [Remarks] Proteasome Phase separation for destruction
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/english/topics/2020/e-0206.html
• [Remarks] 不要なタンパク質が分解を受ける前に解きほぐされる仕組み
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2019/1213.html