Reconstitution of gamete integrity using pluripotent stem cells

• Project Area: Ensuring integrity in gametogenesis
• Project/Area Number: 18H05545
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University (2022); Kyushu University (2018-2021)
• Principal Investigator: 林 克彦 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20287486)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平尾 雄二 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, グループ長 (10355349) ; 吉崎 悟朗 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (70281003)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥276,900,000 (Direct Cost: ¥213,000,000、Indirect Cost: ¥63,900,000); Fiscal Year 2022: ¥51,350,000 (Direct Cost: ¥39,500,000、Indirect Cost: ¥11,850,000); Fiscal Year 2021: ¥48,490,000 (Direct Cost: ¥37,300,000、Indirect Cost: ¥11,190,000); Fiscal Year 2020: ¥50,310,000 (Direct Cost: ¥38,700,000、Indirect Cost: ¥11,610,000); Fiscal Year 2019: ¥50,310,000 (Direct Cost: ¥38,700,000、Indirect Cost: ¥11,610,000); Fiscal Year 2018: ¥76,440,000 (Direct Cost: ¥58,800,000、Indirect Cost: ¥17,640,000)
• Keywords: 生殖細胞 / 卵母細胞 / 生殖幹細胞 / 支持細胞 / 精原幹細胞 / 多能性幹細胞 / 原始卵胞 / 卵胞構造 / in vitro gametogenesis / 体外培養

Outline of Annual Research Achievements

本年度の研究実績の概要は主にふたつである。ひとつは卵子をかたちづくる遺伝子ネットワークを解明したこと。もうひとつは卵子をつくる体細胞環境を再構築したことである。
卵母細胞系列の分化過程の遺伝子発現を解析してみると、原始卵胞から一次卵胞への移行期間において大きな遺伝子発現の変化があることがわかった。この遺伝子発現変化では卵母細胞をかたちづくる構造タンパクをコードする遺伝子の多くが発現を開始することがわかった。次にこの遺伝子発現変化を制御する転写因子を遺伝子欠損および強制発現系によって同定した。面白いことに、これらの解析により同定された８つの遺伝子をES細胞に強制発現したところ、わずか5日のうちに初期卵母細胞と同様の細胞に変化し、卵巣の体細胞と共培養すると成熟卵母細胞とそっくりな細胞に変化した。このことにより、これらの8つの転写因子が卵子をかたちづくる遺伝子発現プログラムを制御していることが明らかになった。本成果は2021年1月に出版されたNatureに掲載された。
次に本研究では卵巣（卵胞）の環境を多能性幹細胞から再構築し、胎仔組織に依存しないin vitro gametogenesisを確立することを目指している。これまでに卵巣の体細胞の分化過程を可視化できる様々なレポーターES細胞を樹立している。本年度において、樹立した各種レポーターES細胞を用いた条件検討により、卵巣の体細胞のマーカーであるNr5a1を発現する細胞を分化誘導することに成功した。これらの細胞とES細胞由来の始原生殖細胞様細胞を凝集培養した結果、卵子にまで成長することが明らかとなった（論文投稿中）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度においては卵子をかたちづくる転写因子群の同定に至った。これは長年不明だった卵母細胞の成長スイッチの分子機構を解明した点において意義深い。また転写因子の強制発現により卵子様の細胞が容易に得られるようになった。卵子の細胞質は体細胞核をもリプログラミングする特殊な能力をもち、クローン動物の作製や生殖補助医療（卵細胞質置換によるミトコンドリア病の克服）などに欠かすことのできない生体材料である。本研究により、遺伝子の強制発現により卵子の細胞質と同等の材料が得られる可能性が示唆され、将来的な技術開発が期待できる。このことは本領域研究の目的であるin vitro gametogenesisの利便性の向上に貢献すると考えられる。
また、これまでに卵巣の体細胞を多能性幹細胞から分化誘導する培養方法を確立している。この方法で得られた細胞はES細胞由来の始原生殖細胞様細胞を卵子にまで成長させる能力をもつ。このことから、これまで卵子への分化に必須であった胎仔卵巣の体細胞は必要なくなり、卵子の作製はES細胞のみから行えるようになった。これによりin vitro gametogenesisの他の動物への応用の可能性が飛躍的に向上した。またこの成果は体細胞から卵母細胞へ与えるシグナル等を容易に解析できる実験系の構築にも貢献すると思われる。
以上の理由から、本研究は概ね順調に進展していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

今回の研究で同定された転写因子群がどのようなメカニズムで卵母細胞の成長を促しているのかを明らかにする。具体的にはこれらの転写因子がゲノム上のどの部分に結合しているかを明らかにする。またその結合により発現が制御されている遺伝子群についても明らかにする。これによりこれらの転写因子を起点とした卵母細胞の成長を促す遺伝子ネットワークの全貌を明らかにし、卵子構築の理解を深める。
また、多能性幹細胞から分化誘導して得られた卵巣の体細胞の機能性を検証する。具体的には分化誘導した卵巣の体細胞と共培養して得られたES細胞由来の卵子を体外受精に供し、その卵子の発生能を検証する。これにより産仔が得られた場合は論文として発表する。またこれと同時に他の動物についても同様に多能性幹細胞から卵巣の体細胞を分化誘導するシステムの構築に研究を進展させる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] MRC London(英国)
• [Int'l Joint Research] Leibniz Institute/The Max Delbruck Center(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] Max Delbrick Center (MDC)/The Leibniz Institute (IZW)(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] Max Delbrick Center (MDC)/The Leibniz Institute (IZW)(ドイツ)
• [Journal Article] Reconstitution of the oocyte transcriptional network with transcription factors (2021)
  • Author(s): Nobuhiko Hamazaki, Hirohisa Kyogoku, Hiromitsu Araki, Fumihito Miura, Chisako Horikawa, Norio Hamada, So Shimamoto, Orie Hikabe, Kinichi Nakashima, Tomoya S. Kitajima, Takashi Ito, Harry G. Leitch, Katsuhiko Hayashi
  • Journal Title: Nature Volume: 589 Pages: 264-269
  • DOI: 10.1038/s41586-020-3027-9
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Germ cell-intrinsic effects of sex chromosomes on early oocyte differentiation in mice. (2020)
  • Author(s): Hamada N, Hamazaki N, Shimamoto S, Hikabe O, Nagamatsu G, Takada Y, Kato K, Hayashi K.
  • Journal Title: PLOS Genetics Volume: 16
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1008676
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Environmental factors for establishment of the dormant state in oocytes (2020)
  • Author(s): Hayashi Katsuhiko、Shimamoto So、Nagamatsu Go
  • Journal Title: Dev Growth Differ Volume: 62 Pages: 150-157
  • DOI: 10.1111/dgd.12653
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mechanical stress accompanied with nuclear rotation is involved in the dormant state of mouse oocytes. (2019)
  • Author(s): Nagamatsu G, Shimamoto S, Hamazaki N, Nishimura Y, Hayashi K.
  • Journal Title: Sci Adv Volume: 5
  • DOI: 10.1126/sciadv.aav9960
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hypoxia induces the dormant state in oocytes through expression of Foxo3. (2019)
  • Author(s): Shimamoto S, Nishimura Y, Nagamatsu G, Hamada N, Kita H, Hikabe O, Hamazaki N, Hayashi K.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 116 Pages: 12321-12326
  • DOI: 10.1073/pnas.1817223116
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro reconstitution of germ cell development† (2019)
  • Author(s): Hayashi Katsuhiko
  • Journal Title: Biol Reprod Volume: 101 Pages: 567-578
  • DOI: 10.1093/biolre/ioz111
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stem Cell-Derived Human Gametes: The Public Engagement Imperative. (2019)
  • Author(s): Adashi EY, Cohen IG, Hanna JH, Surani AM, Hayashi K.
  • Journal Title: Trends in Molecular Medicine Volume: 25 Pages: 165-167
  • DOI: 10.1016/j.molmed.2019.01.005
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Embryos and embryonic stem cells from the white rhinoceros. (2018)
  • Author(s): Hildebrandt TB, Hermes R, Colleoni S, Diecke S, Holtze S, Renfree MB, Stejskal J, Hayashi K, Drukker M, Loi P, Groitz F, Lazzari G, Galli C.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 9 Pages: 2589-2589
  • DOI: 10.1038/s41467-018-04959-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Artificially produced gametes in mice, humans and other species (2021)
  • Author(s): HAYASHI, Katsuhiko
  • Organizer: International Embryo Technology Society
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Oocyte production in culture toward application to species conservation (2021)
  • Author(s): HAYASHI, Katsuhiko
  • Organizer: International Society for Stem Cell Research
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 卵母細胞形成における性染色体の機能 (2020)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 日本内分泌学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] Understanding of mammalian oogenesis by reconstitution in vitro (2020)
  • Author(s): HAYASHI, Katsuhiko
  • Organizer: 日本発生生物学会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of transcription factors orchestrating oocyte growth (2020)
  • Author(s): HAMAZAKI, Nobuhiko and HAYASHI, Katsuhiko
  • Organizer: 日本分子生物学会
• [Presentation] 生殖細胞再生技術の最前線 (2020)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 日本生殖医学会
  • Invited
• [Presentation] Basic Research:In-Vitro Oogenesis from Pluripotent Stem Cells (2020)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: ASPIRE 8th Masterclass
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Generating and modifying functional sperm and eggs from stem cells (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: De Snoo van ‘t Hoogerhuijs Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Stem Cells ~Regeneration of Oocytes~ (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: World Congress of International Federation of Fertility
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Reconstitution and Understanding of Mammalian Oogenesis (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: 浙江省医学会生殖医学分会
  • Invited
• [Presentation] 実験動物における生殖細胞系列再構築系の展開 (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 第66回日本実験動物学会総会
  • Invited
• [Presentation] Reconstitution and understanding of mammalian oogenesis (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: Stem Cell Symposium
  • Invited
• [Presentation] 原始卵胞の成立機序と人工的作製 (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 生殖バイオロジー東京シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 卵母細胞系列の再構築系の現状と課題 (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 千里ライフサイエンスセミナー オルガノイド研究の現状と課題
  • Invited
• [Presentation] 卵母細胞の休止状態が保たれるメカニズム (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 日本遺伝学会第91回大会
  • Invited
• [Presentation] 生殖細胞誘導システムを構築するための動物細胞を用いた前衛的研究 (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 第22回日本IVF学会
  • Invited
• [Presentation] Gametes from pluripotent stem cells (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: International Scciety of In Vitro Fertilization
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 卵子が長生きするしくみ -マウスの知見から- (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 第34回日本女性医学学会
  • Invited
• [Presentation] Reconstitution of mammalian oogenesis using pluripotent stem cells (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: International Society of Fertility Preservation
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 個体の起源とその構築 (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 第64回日本人類遺伝学会
  • Invited
• [Presentation] A mechanism underlying sustainable oocyte production in mouse germ line (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会
• [Presentation] コモンマーモセットES細胞を用いた生殖細胞系列の再構築の試み (2019)
  • Author(s): 林克彦
  • Organizer: マーモセット研究会
  • Invited
• [Presentation] Regeneration of Eggs from Skin (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: Update in Infertility
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] A stem cell-based approach to understanding of mammalian oogenesis (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: SY-Stem
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Reconstitution and Understanding of Mammalian Oogenesis (2019)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: BDR symposium 2019 Control and Design of Biosystems
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] in vitro gametogenesis from stem cells (2018)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: Medicine Korean Society for Reproductive Medicine
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Oocytes from stem cells and back (2018)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: ESHRE
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] A mechanism ensuring a dormant state of oocytes in the ovary (2018)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: Stem Cell Dynamics Throughout Life
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Understanding of early oocyte differentiation using a in vitro oogenesis model (2018)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: 5th Fronteirs in Reprodtive Biology
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] A novel approach to understanding oogenesis with in vitro reconstitution system (2018)
  • Author(s): Katsuhiko Hayashi
  • Organizer: EMBO: Molecular Mechanisms of Developmental and Regenerative Biology
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 卵子をかたち作る遺伝子群を同定 ～卵細胞質の大量作製が可能に～
• [Patent(Industrial Property Rights)] 多能性幹細胞から卵巣組織を再生する培養技術 (2021)
  • Inventor(s): 林克彦、吉野剛史
  • Industrial Property Rights Holder: 林克彦、吉野剛史
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2021
• [Patent(Industrial Property Rights)] 始原生殖細胞をin vitroで原始卵胞に分化する方法 (2019)
  • Inventor(s): 永松剛、林克彦
  • Industrial Property Rights Holder: 永松剛、林克彦
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2019
  • Overseas