Establishment of in vitro oogenesis with high integrity

• Project Area: Ensuring integrity in gametogenesis
• Project/Area Number: 18H05547
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 尾畑 やよい 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70312907)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥110,500,000 (Direct Cost: ¥85,000,000、Indirect Cost: ¥25,500,000); Fiscal Year 2022: ¥23,790,000 (Direct Cost: ¥18,300,000、Indirect Cost: ¥5,490,000); Fiscal Year 2021: ¥23,790,000 (Direct Cost: ¥18,300,000、Indirect Cost: ¥5,490,000); Fiscal Year 2020: ¥23,790,000 (Direct Cost: ¥18,300,000、Indirect Cost: ¥5,490,000); Fiscal Year 2019: ¥23,790,000 (Direct Cost: ¥18,300,000、Indirect Cost: ¥5,490,000); Fiscal Year 2018: ¥15,340,000 (Direct Cost: ¥11,800,000、Indirect Cost: ¥3,540,000)
• Keywords: 卵子 / 卵子形成過程 / 発生能 / 卵子形成 / 卵胞形成 / エピジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

生体内に匹敵する“高インテグリティを実現するin vitro卵子産生系”を構築することを最終目標として、2021年度は以下の研究を実施した。
1）卵母細胞のRNA-seq解析および生理学的特徴の解析
RNA-seq解析でin vitro由来卵でセラミドの代謝経路が過剰に活性化している可能性が示唆された。そこで、卵内のセラミドを定量した結果、in vitro由来卵ではin vivo由来卵のおよそ2倍のセラミドを含有することが示された。過剰なセラミドは細胞内でdeath signalとして働きミトコンドリア損傷をもたらすことが報告されている。このことは、in vitro由来卵のミトコンドリア膜電位がin vivo由来卵よりも有意に低いことと一致した。一方、これまで定法としてきた通常酸素条件（20%酸素）で産生した卵に比べて低酸素条件（7%酸素）で産生した卵は高い発生支持能を有することが明らかとなった。低酸素条件で産生した卵では、セラミド含量がin vivo由来卵と同程度まで下方修正され、ミトコンドリア膜電位の回復も認められた。また、低酸素条件で産生した卵の遺伝子発現プロファイルは、階層的クラスタリング解析では、依然としてin vivo由来卵とは異なる集団を形成したが、ごく一部の卵がin vivo由来卵と同一の集団に分類された。これらの卵では、Noboxとよばれる転写因子の発現が回復しており、Noboxの発現量と高い相関を示す遺伝子の多くは卵形成に不可欠な因子であることが示された。
2）in vitro卵子産生系のためのChemically Defined Medium (CDM) の検討
新しい培養デバイスが再び製造停止となり、再度デバイスの検討を余儀なくされた。その結果、CDMを用いたマウス胎仔卵巣の培養により、血清添加培地と同程度の二次卵胞が形成される系が確立できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度、本研究で用いる培養デバイスが販売停止となり、代替デバイスを検討し確立した矢先に、再び当該デバイスが販売停止となった。これまでと全く同様ではないが、再度となる代替デバイスの選定も概ね完了し、培養系がworkすることは検証済みである。
一方、卵の分子生物学的な解析が進展した。卵子形成過程におけるレトロトランスポゾンの抑制機構が精子形成過程とは異なることを見出し、論文掲載に至った。さらに、卵のRNA-seq解析、生理学的解析およびリピドミクス解析により、in vitro卵の異常を明らかにし、インテグリティ低下の要因となる候補因子の抽出に至った。これらの研究成果も論文掲載に至った。また、in vitroにおける卵の産生系として、酸素条件および高分子化合物として添加しているPolyvinylpyrrolidoneの分子量の至適条件を検討し、これらの結果も論文掲載に至った。

Strategy for Future Research Activity

最終年度であることを踏まえ、これまでの研究結果を集約していく。そのための推進方策は以下の通りである。
1）in vitro卵子形成で遺伝子の機能補完を実施し、不妊雌マウスの卵巣から卵を産生し産仔を得ることで、in vitro系のロバストネスを示す。
2）生体由来の未授精卵および二次卵胞の成長・成熟培養で産生された未授精卵それぞれをConfocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis（CRIF法）に供試し、細胞小器官の情報、自家蛍光パターンの情報、受精能および発生能を機械学習し、発生支持能を非破壊的に予見するための情報を集積していくことで、非破壊的に発生能を予見するための新しい技術を構築する。
3）これまでにマウス胎仔卵巣のCDMによる器官培養と10日齢マウス二次卵胞のCDMによる卵胞培養をそれぞれ個別に検討してきた。リコンビナントタンパク質、ミネラル、脂質、高分子化合物などの添加により、前者では二次卵胞が、後者では成熟卵子を分化させることが可能となった。これまでのRNA-seq解析の結果などを踏まえ、培地への添加物をさらに検討し、今年度はCDMにより器官培養と卵胞培養でマウス胎仔PGCから成熟卵子を産生する。また、確立したCDMの結果をもとに卵子形成に寄与する物質的な基盤を総括する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Harvard Medical School(米国)
• [Int'l Joint Research] Northwest Normal University(中国)
• [Int'l Joint Research] Northwest Normal University(中国)
• [Int'l Joint Research] Harvard Medical School(米国)
• [Int'l Joint Research] Northwest Normal University(中国)
• [Int'l Joint Research] Harvard Medical School(米国)
• [Journal Article] Disruption of piRNA machinery by deletion of ASZ1/GASZ results in the expression of aberrant chimeric transcripts in gonocytes (2022)
  • Author(s): Ikeda S, Tanaka K, Ohtani R, Kanda A, Sotomaru Y, Kono T, Obata Y.
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 68 Issue: 2 Pages: 125-136
  • DOI: 10.1262/jrd.2021-146
  • NAID: 130008145874
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Insights into in vivo follicle formation: a review of in vitro systems. (2022)
  • Author(s): Tanimoto R, Yoshida K, Ikeda S, Obata Y.
  • Journal Title: Histochem Cell Biol. Volume: 157 Issue: 3 Pages: 333-345
  • DOI: 10.1007/s00418-021-02058-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Optimal conditions for mouse follicle culture (2021)
  • Author(s): Ota S, Ikeda S, Takashima T, Obata Y.
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 67 Issue: 5 Pages: 327-331
  • DOI: 10.1262/jrd.2021-091
  • NAID: 130008112026
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. (2021)
  • Author(s): Takashima T, Fujimaru T, Obata Y.
  • Journal Title: Reproduction. Volume: 162 Issue: 4 Pages: 307-318
  • DOI: 10.1530/rep-21-0209
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Oocyte-specific gene knockdown by intronic artificial microRNAs driven by <i>Zp3</i> transcription in mice (2021)
  • Author(s): Sasaki K, Takaoka S, Obata Y
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 67 Issue: 3 Pages: 229-234
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-146
  • NAID: 130008055064
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Blocking estrogen-induced AMH expression is crucial for normal follicle formation (2021)
  • Author(s): Tanimoto Ren、Sekii Kiyono、Morohaku Kanako、Li Jianzhen、Pepin David、Obata Yayoi
  • Journal Title: Development Volume: 148 Issue: 6
  • DOI: 10.1242/dev.197459
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish (2021)
  • Author(s): Wang W, Kang T, Bai L, Hu W, Obata Y, Li J
  • Journal Title: J Vis Exp Volume: 170 Issue: 170
  • DOI: 10.3791/62027
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dnmt3a2/Dnmt3L Overexpression in the Dopaminergic System of Mice Increases Exercise Behavior through Signaling Changes in the Hypothalamus (2020)
  • Author(s): Cui D, Mesaros A, Burdeos G, Voigt I, Giavalisco P, Hinze Y, Purrio M, Neumaier B, Drzezga A, Obata Y, Endepols H, Xu X
  • Journal Title: Int J Mol Sci Volume: 21 Issue: 17 Pages: 6297-6297
  • DOI: 10.3390/ijms21176297
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 哺乳類の卵子を体外で産生する (2019)
  • Author(s): 諸白家奈子、尾畑やよい
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 97 Pages: 212-212
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ectopic expression of DNA methyltransferases DNMT3A2 and DNMT3L leads to aberrant hypermethylation and postnatal lethality in mice (2019)
  • Author(s): Sasaki Keisuke、Hara Satoshi、Yamakami Reina、Sato Yusuke、Hasegawa Saki、Kono Tomohiro、Morohaku Kanako、Obata Yayoi
  • Journal Title: Molecular Reproduction and Development Volume: 印刷中 Issue: 6 Pages: 614-623
  • DOI: 10.1002/mrd.23137
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 哺乳動物の卵子を体外で産生する (2019)
  • Author(s): 諸白家奈子、尾畑やよい
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 97 Pages: 21-21
  • Peer Reviewed
• [Presentation] マウス体外成長卵母細胞の発生能に影響しうる因子の探査 (2021)
  • Author(s): 高島友弥、藤丸翼、尾畑やよい
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
• [Presentation] Y染色体の存在がマウス雌性生殖系列に及ぼす影響 (2020)
  • Author(s): 佐藤義治、坂下陽彦、神田暁史、河野友宏、外丸祐介、尾畑やよい
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
• [Presentation] マウス胎仔卵巣培養のための完全合成培地の構築にむけて (2020)
  • Author(s): 木村覚、池田晋也、荒井美希、吉田幸太郎、尾畑やよい
  • Organizer: 日本卵子学会
• [Presentation] 卵母細胞特異的遺伝子ノックダウンシステムの開発 (2019)
  • Author(s): 佐々木恵亮、尾畑やよい
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Invited
• [Presentation] 合成培地におけるin vitroマウス卵子形成 (2019)
  • Author(s): 木村覚、池田晋也、尾畑やよい
  • Organizer: 日本分子生物学会
• [Presentation] 卵母細胞特異的ノックダウンシステムの確立 (2019)
  • Author(s): 佐々木恵亮、高岡沙綾、尾畑やよい
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
• [Presentation] レトロトランスポゾンの脱抑制がマウス前精原細胞の遺伝子発現制御に与える影響 (2019)
  • Author(s): 池田晋也、田中康貴、大谷麗子、飯田有紀、樋浦仁、外丸祐介、尾畑やよい、河野友宏
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
• [Presentation] マウス始原生殖細胞で発現するsmall RNA (2018)
  • Author(s): 高島友弥、横田将、樋浦仁、小林久人、尾畑やよい、小川英彦、河野友宏
  • Organizer: 日本分子生物学会
• [Presentation] 卵子形成を再現するin vitro系の開発 (2018)
  • Author(s): 尾畑やよい
  • Organizer: 日本生殖免疫学会
  • Invited
• [Presentation] 体外成長卵母細胞から作出したマウス2細胞期胚のトランスクリプトーム解析 (2018)
  • Author(s): 藤丸翼、谷本連、小林久人、河野友宏、尾畑やよい
  • Organizer: 日本繁殖生物学会
• [Presentation] 卵胞成長培地に添加するポリビニルピロリドンの分子量が卵の成熟および発生に及ぼす影響 (2018)
  • Author(s): 尾畑やよい、諸白家奈子、廣江綾香、田口精一
  • Organizer: 日本卵子学会
• [Remarks] 東京農業大学生命科学部バイオサイエンス学科動物発生工学研究室HP
  • URL: https://www.nodai.ac.jp/academics/life_sci/bio/lab/505/
• [Remarks] 配偶子インテグリティの構築HP
  • URL: https://www.gamete-integrity.com
• [Remarks] 東京農業大学HP
  • URL: https://www.nodai.ac.jp/academics/life_sci/bio/lab/505/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 品質評価方法及び品質評価プログラム (2022)
  • Inventor(s): 八幡穣、野村暢彦、高部響介、尾畑やよい（9番目）、他5名
  • Industrial Property Rights Holder: 筑波大学、東京農業大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2022-043135
  • Filing Date: 2022