Analysis of repertoire dynamics of germ cell development

• Project Area: Ensuring integrity in gametogenesis
• Project/Area Number: 18H05551
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 吉田 松生 基礎生物学研究所, 生殖細胞研究部門, 教授 (60294138)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 隼明 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 助教 (30613723)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥119,210,000 (Direct Cost: ¥91,700,000、Indirect Cost: ¥27,510,000); Fiscal Year 2022: ¥23,270,000 (Direct Cost: ¥17,900,000、Indirect Cost: ¥5,370,000); Fiscal Year 2021: ¥23,010,000 (Direct Cost: ¥17,700,000、Indirect Cost: ¥5,310,000); Fiscal Year 2020: ¥21,840,000 (Direct Cost: ¥16,800,000、Indirect Cost: ¥5,040,000); Fiscal Year 2019: ¥21,060,000 (Direct Cost: ¥16,200,000、Indirect Cost: ¥4,860,000); Fiscal Year 2018: ¥30,030,000 (Direct Cost: ¥23,100,000、Indirect Cost: ¥6,930,000)
• Keywords: 生殖細胞 / レパートリー / 細胞系譜 / バーコーディング

Outline of Annual Research Achievements

2019年度は以下のような研究を遂行し、生殖細胞の発生様式の異なる哺乳類と鳥類における配偶子インテグリティ成立プロセスの解析を進めた。
まず、2018年度に開発を進めたマウスの発生期の生殖細胞の遺伝子バーコーディング実験系の有用性を確認した。具体的には、妊娠マウスに薬剤（タモキシフェン）を投与することで、胎児の生殖細胞特異的に多数の異なる配列（バーコード）を導入する実験条件を確立し、発生の進んだ段階で生殖腺あるいは生殖細胞を回収して、そのゲノム領域に含まれるバーコード配列をPCR増幅したのちに次世代シーケンサで解析した。その結果、計画通りに生殖細胞に多様なバーコードが導入されることを確認し、得られたシーケンスデータを統計的に解析してレパートリー数の推計を開始した。次いで、2018年度にマウス精巣を異なる温度で培養して明らかにした、in vitro精子形成、特に減数分裂の進行が高温によって妨げられる分子メカニズムの解明を進め、温度感受性ステップを絞り込んだ（以上は、研究代表者吉田が行った）。
鳥類においては、2018年度に樹立したニワトリ生殖細胞の培養系を用いて、生殖細胞への遺伝子導入法を検討した。具体的には、培養生殖細胞に外来遺伝子をトランスフェクションし、蛍光あるいは薬剤耐性によって恒常的にGFPを発現する生殖細胞株の選別を進めている。また、選別した少数の生殖細胞の培養が困難であるため、単一細胞から効率的に増幅する培養法の開発を進めている (以上は、研究分担者中村が行った）。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上記のように本研究は進行している。バーコード導入や培養条件の最適に当初計画以上に時間がかかった上、新型コロナウイルス感染症の広がりで動物実験のスローダウンを余儀なくされた。しかし、着実に実験条件の最適化を進めることができ、今後信頼できるデータの取得が期待される。

Strategy for Future Research Activity

基本的には、現在進行している研究を推進することで、本研究の目的の達成を目指す。いずれも、本研究領域の研究の進展に貢献することが期待される。マウス生殖細胞のレパートリー動態については、本年度までに確立した実験系を用いて多数回の解析を行ってデータを蓄積する。海外研究協力者とともに数理統計解析を行い、個体に含まれる生殖細胞レパートリーの変遷を推定する。レパートリーが減少する段階が同定されれば、その時期の生殖細胞の不均一性を検討する。さらに、細胞系譜と遺伝子発現の情報を紐づけて解析する実験系を導入する。精子形成の高温感受性については、異なる温度において器官培養を行なった精巣サンプルを用いて、減数分裂の進行に関わる分子マシナリーの存在や局在、染色体の状態を詳細に解析する。それによって、高温で障害を受ける減数分裂のステップと分子マシナリーを絞り込む。鳥類生殖細胞については、ニワトリ培養生殖細胞への効率的な遺伝子導入法を確立し、恒常的にGFPを発現する細胞株を樹立する。次いで、生殖細胞株を移植し、検定交雑で得られた後代の遺伝子型と表現型を解析して、恒常的にGFPを発現する遺伝子導入ニワトリを選別する。さらに、ニワトリ培養生殖細胞に適した凍結保存法を開発し、樹立した細胞株の凍結保存を進める。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ドイツがん研究センター（DKFZ）/ハイデルベルク大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ロスリン研究所/ケンブリッジ大学(英国)
• [Int'l Joint Research] シンシナティ大学(米国)
• [Int'l Joint Research] ミナス・ジェライス連邦大学(ブラジル)
• [Int'l Joint Research] ドイツがん研究センター（DKFZ）/ハイデルベルク大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ロスリン研究所(英国)
• [Journal Article] Transient suppression of transplanted spermatogonial stem cell differentiation restores fertility in mice (2021)
  • Author(s): Nakamura Yoshiaki、Jorg David J.、Kon Yayoi、Simons Benjamin D.、Yoshida Shosei
  • Journal Title: Cell Stem Cell Volume: - Pages: 1-14
  • DOI: 10.1016/j.stem.2021.03.016
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye (2021)
  • Author(s): Yeh Yu-Han、Hu Mengwen、Nakagawa Toshinori、Sakashita Akihiko、Yoshida Shosei、Maezawa So、Namekawa Satoshi H.
  • Journal Title: J Vis Exp Volume: -
  • DOI: 10.3791/61666
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Stem Cell Populations as Self-Renewing Many-Particle Systems (2021)
  • Author(s): Jorg David J.、Kitadate Yu、Yoshida Shosei、Simons Benjamin D.
  • Journal Title: Annual Review of Condensed Matter Physics Volume: 12 Pages: 135-153
  • DOI: 10.1146/annurev-conmatphys-041720-125707
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] EXOC1 regulates cell morphology of spermatogonia and spermatocytes in mice (2021)
  • Author(s): Osawa Y、Murata K、Usui M、Kuba Y、Le Hoai T、Mikami N、Nakagawa T、Daitoku Y、Kato K、Shawki Hossam H、Ikeda Y、Kuno A、Morimoto K、Tanimoto Y、Huong Dinh Tra T、Yagami K、Ema M、Yoshida S、Takahashi S、Mizuno S、Sugiyama F
  • Journal Title: eLife Volume: -
  • DOI: 10.1101/2020.06.07.139030
  • Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 精子幹細胞研究の展開：見えてきた個のランダム性と集団の安定性 (2021)
  • Author(s): 吉田松生
  • Journal Title: 生化学 Volume: -
• [Journal Article] 精子幹細胞のランダムな挙動からニッチの役割を考える (2021)
  • Author(s): 吉田松生
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 72 Pages: 1-5
• [Journal Article] A Growth Performance and Nonlinear Growth Curve Functions of Large- and Normal-Sized Japanese Quail (<i>Coturnix japonica</i>) (2021)
  • Author(s): Haqani Mohammad I.、Kawamura Kensuke、Takenouchi Atsushi、Kabir Mohammad H.、Nakamura Yoshiaki、Ishikawa Akira、Tsudzuki Masaoki
  • Journal Title: J. Poult. Sci. Volume: - Issue: 2 Pages: 88-96
  • DOI: 10.2141/jpsa.0200020
  • NAID: 130008029804
  • ISSN: 1346-7395, 1349-0486
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tracing the cellular basis of islet specification in mouse pancreas (2020)
  • Author(s): Sznurkowska Magdalena K.、Hannezo Edouard、Azzarelli Roberta、Chatzeli Lemonia、Ikeda Tatsuro、Yoshida Shosei、Philpott Anna、Simons Benjamin D.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 11 Pages: 5037-5037
  • DOI: 10.1038/s41467-020-18837-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Spermatogonial asynchrony in Tex14 mutant mice lacking intercellular bridges (2020)
  • Author(s): Rezende-Melo C A、Caldeira-Brant A L、Drumond-Bock A L、Buchold G M、Shetty G、Almeida F R C L、Matzuk M M、Hara K、Yoshida S、Meistrich M L、Chiarini-Garcia H
  • Journal Title: Reproduction Volume: 160 Pages: 205-215
  • DOI: 10.1530/rep-20-0118
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mouse spermatogenesis reflects the unity and diversity of tissue stem cell-niche systems. (2020)
  • Author(s): Yoshida, S.
  • Journal Title: Cold Spring Harbor Perspectives in Biology Volume: -
  • DOI: 10.1101/cshperspect.a036186
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heterogeneous, dynamic, and stochastic nature of mammalian spermatogenic stem cells. (2019)
  • Author(s): Yoshida, S.
  • Journal Title: Curr Top Dev Biol Volume: 135 Pages: 245-285
  • DOI: 10.1016/bs.ctdb.2019.04.008
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Wnt produced by stretched roof-plate cells is required for the promotion of cell proliferation around the central canal of the spinal cord (2019)
  • Author(s): Shinozuka Takuma、Takada Ritsuko、Yoshida Shosei、Yonemura Shigenobu、Takada Shinji
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: 146 Pages: 159343-159343
  • DOI: 10.1242/dev.159343
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Competition for Mitogens Regulates Spermatogenic Stem Cell Homeostasis in an Open Niche (2019)
  • Author(s): Kitadate Y., Jorg DJ., Tokue M,. Maruyama A., Ishikawa R., Tsuchiya S., Segi-Nishida E., Nakagawa T., Uchida A., Kimura-Yoshida C., Mizuno S., Sugiyama F., Azami T., Ema M., Noda C., Kobayashi S., Matsuo I., Kanai Y., Nagasawa T., Sugimoto Y., Takahashi S., Simons BD., Yoshida S.
  • Journal Title: Cell Stem Cell. Volume: 24 Pages: 1-2
  • DOI: 10.1016/j.stem.2018.11.013
  • NAID: 120007128265
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Developmental stages of the blue-breasted quail (Coturnix chinensis). (2019)
  • Author(s): Y. Nakamura, Y. Nakane and M. Tsudzuki
  • Journal Title: Anim Sci J Volume: 90 Pages: 35-48
  • DOI: 10.1111/asj.13119
  • NAID: 120006554901
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Skeletal development in blue-breasted quail embryos. (2019)
  • Author(s): Y. Nakamura, Y. Nakane and M. Tsudzuki
  • Journal Title: Anim Sci J Volume: 90 Pages: 353-365
  • DOI: 10.1111/asj.13159
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] mDia1/3 generate cortical F-actin meshwork in Sertoli cells that is continuous with contractile F-actin bundles and indispensable for spermatogenesis and male fertility. (2018)
  • Author(s): S. Sakamoto, D. Thumkeo, H. Ohta, Z. Zhang, S.R. Huang, P. Kanchenawong, T. Fuu, S. Watanabe, K. Shimada, Y. Fujihara, S. Yoshida, M. Ikawa, N. Watanabe, M. Saitou and S. Narumiya
  • Journal Title: PLoS Biol Volume: 16
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.2004874
  • NAID: 120006531249
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Open niche regulation of mouse spermatogenic stem cells (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Journal Title: Dev Growth Differ Volume: 60 Pages: 542-552
  • DOI: 10.1111/dgd.12574
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 精子幹細胞と精巣の開放型ニッチ 特集「幹細胞の恒常性維持とその破綻」 (2018)
  • Author(s): 吉田松生
  • Journal Title: 月刊細胞 Volume: 50 Pages: 15-18
  • NAID: 40021598195
  • Open Access
• [Presentation] 精子幹細胞研究の展開：見えてきた個のランダム性と集団の安定性 (2021)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 第3回せとうちART研究会
  • Invited
• [Presentation] 龍神地鶏初期発生における始原生殖細胞数の調査 (2021)
  • Author(s): 小出茅洋, 濵井奈津子, 橋本典和, 都築政起, 中村隼明
  • Organizer: 2021年度日本家禽学会春季大会
• [Presentation] ニワトリ始原生殖細胞に適した凍結保存液の開発 (2021)
  • Author(s): 濵井奈津子, 小出茅洋, 都築政起, 中村 隼明
  • Organizer: 日本畜産学会第128回大会
• [Presentation] Maintenace of homeostasis and highjack by non-neutral stem cell clones in mouse spermatogenesis. (2020)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: Cold Spring Harbor Laboratory Meeting on Germ Cells
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Sperm production with minimal mutations. S4: Developmental mechanisms underlying sexual reproduction (2020)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: JSDB Online Trial Meeting 2020
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 宿主精巣に移植した精子幹細胞はストカスティックな運命を辿る (2020)
  • Author(s): 中村隼明，David J Jorg,Benjamin D Simons,吉田松生
  • Organizer: 第113回日本繁殖生物学会
• [Presentation] マウス精子形成の温度チェックポイントのex vivo 培養による解明 (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: Biothermology Workshop 2019’ Annual Workshop
  • Invited
• [Presentation] Robust spermatogenesis is supported by random behavior and simple regulation of stem cells (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会シンポジウム 4S-11 “Robustness of germline lineage”
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Temperature sensitivity of mouse spermatogenesis. (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: Memorial Conference for Dr. Goro Eguchi in Kumamoto
  • Invited
• [Presentation] 精子幹細胞の集団動態と次世代へ伝わる変異へのインパクト (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 日本遺伝学会第91回大会シンポジウム“遺伝学会・新学術「配偶子インテグリティ」共催シンポ：「個体を潜り抜けるための遺伝戦略」”
  • Invited
• [Presentation] マウス精子形成幹細胞の気ままな振る舞いとその制御 (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 2019遺伝研研究会
  • Invited
• [Presentation] ひとつひとつの幹細胞のランダムなふるまいが安定した精子形成を支える (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 第17回幹細胞シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Unique differentiation processes support the sharp seasonal response of Japanese quail spermatogenesis. (2019)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: The annual meeting of the Japanese Society of Developmental Biologists
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Open niche regulation of spermatogenic stem cells in the mouse testis. (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Organizer: The 5th Conference of Frontiers in Reproductive Biology,
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Rapid and robust seasonal breeding in Japanese quail supported by unique process of spermatogenesis. (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Organizer: Cold Spring Harbor Laboratory Meeting on Germ Cells
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Towards a Better Understanding of Spermatogenic Stem Cells. (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Organizer: The Society for the Study of Reproduction 51st Annual Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Sperm stem cells: their context-dependent behavior. (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Organizer: ISSCR 2018
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 精子形成幹細胞のホメオスタシス維持システムとその経時変化 (2018)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 千里ライフサイエンスセミナーM1＜老化メカニズムと疾患制御＞
  • Invited
• [Presentation] Flexible and stochastic behavior of spermatogenic stem cells. (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Organizer: The 20th European Testis Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] For a Better Understanding of Spermatogenic Stem Cell Dynamics Over Time. (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Organizer: 11th NYRA Meeting, preceding the 20th European Testis Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 精子を作る細胞たち：個のランダム性が集団を支える (2018)
  • Author(s): 吉田松生
  • Organizer: 大隅基礎科学創成財団「第二回創発セミナー」
  • Invited
• [Presentation] 生殖細胞の凍結・移植による家禽遺伝資源の長期保存 (2018)
  • Author(s): 中村隼明
  • Organizer: 日本農芸化学会2018年度大会 シンポジウム「鳥類の農芸化学」
  • Invited
• [Presentation] Embryonic Development of the Blue-Breasted Quail (Coturnix chinensis). (2018)
  • Author(s): Nakamura Y, Nakane Y, Tsudzuki M
  • Organizer: Asian Australasian Animal Production Congress 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 「家禽類および齧歯類における生殖細胞の移植を用いたキメラ作製技法」 (2018)
  • Author(s): 中村隼明
  • Organizer: 第111回日本繁殖生物学会大会 大会企画シンポジウム1「キメラ動物作製技術の応用」
  • Invited
• [Book] Regulatory mechanism of spermatogenic stem cells in mice: their dynamic and context-dependent behavior: PartⅠDivesity in Reproductive Stragegies and Germ Cell Differentiation Mechanisms, Animal Diverdity and Gnerality, “Reproductive and Developmental Strategies” (2018)
  • Author(s): S. Yoshida
  • Total Pages: 789
  • Publisher: Springer Japan KK
• [Remarks] 基礎生物学研究所 吉田研究室
  • URL: http://www.nibb.ac.jp/germcell/