組織学的情報とリンクした単一細胞遺伝子発現プロファイル動態の解明

• Project Area: Ensuring integrity in gametogenesis
• Project/Area Number: 18H05553
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥120,770,000 (Direct Cost: ¥92,900,000、Indirect Cost: ¥27,870,000); Fiscal Year 2022: ¥19,240,000 (Direct Cost: ¥14,800,000、Indirect Cost: ¥4,440,000); Fiscal Year 2021: ¥23,270,000 (Direct Cost: ¥17,900,000、Indirect Cost: ¥5,370,000); Fiscal Year 2020: ¥22,620,000 (Direct Cost: ¥17,400,000、Indirect Cost: ¥5,220,000); Fiscal Year 2019: ¥24,050,000 (Direct Cost: ¥18,500,000、Indirect Cost: ¥5,550,000); Fiscal Year 2018: ¥31,590,000 (Direct Cost: ¥24,300,000、Indirect Cost: ¥7,290,000)
• Keywords: 1細胞解析 / LCM / 生殖細胞 / 組織 / 卵 / gem cell / oocyte / histology / 配偶子形成 / シングルセル / 単一細胞 / トランスクリプトーム / 組織切片 / 形態 / 単一細胞解析 / レーザーマイクロダイセクション / Single cell / 1細胞 / RNAseq / 組織学 / 単一細胞トランスクリプトーム / 配偶子 / 品質管理 / 卵子 / 位置情報

Outline of Annual Research Achievements

2020年度は2019年度に引き続き、セルブロックの凍結切片を用いてレーザーマイクロダイセクションにより回収した単一細胞からのRNA溶出効率の改善を行った。昨年度までの課題は、溶出効率が従来法よりも格段に改善し、一旦は論文発表に適したレベルかと期待されたものの、その後の検討で、ブレがおおきく実用性に難があることが判明したことであった。今年度、細胞の可溶化後の添加物を調整するなどで、安定性が向上した。また当初、まったく想定していなかった問題として、本研究で使用してきたRNase inhibitorの一つが販売中止になった。このRNase inhibitorは他の製品と全く異なり、RNaseA等に対するポリクローナル抗体をベースにした唯一のinhibitorであった。本製品は、シングルセルレベルでの微量RNA濃度領域で、他の製品とは比べものにならない阻害活性を示してきた。したがって、本研究のcDNA増幅手法の定量性と感度は、このRNase inhibitorに大きく依存していた。このため、新たなRNase inhibitorの選定と、条件検討には難航したが、試行錯誤の結果、他のRNase inhibitor候補の添加量を標準よりもはるかに増加する工夫を行うなどして、これまでと同程度のRNaseの阻害活性を発揮する、RNase inhibitorとその添加条件の組み合わせを同定することができた。この条件で、2019年度までに行っていたcDNA増幅実験を全てやり直し、データを取り直した。RNA溶出効率の再現性を高める要素技術との相性も検討し、問題がないことを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、本研究で採用していた、研究代表者が長年使用してきた高品質なRNase inhibitorの製造中止が9月に判明し、代替品の検討が難航した。最終的には十分な阻害活性を持つ製品と添加条件の組み合わせを発見することができたが、試薬を変更することになったため、2019年度までに取得したデータは全て取り直しとなった。このため、進捗状況をやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、前半に研究実績の概要でも触れた、RNase inhibitorの更新によるデータの取り直しを完了させる。後半には、新たなRNA溶出法による効果を、次世代シークエンスによって検証する。現在は凍結セルブロックによる手法の検討を行っているが、さらにマウス卵巣を用いて、実際の組織で手法が動くかどうかを検討する。

Research Products

• [Journal Article] Reconstituting oogenesis in vitro: recent progress and future prospects (2021)
  • Author(s): Nagaoka So I.、Saitou Mitinori、Kurimoto Kazuki
  • Journal Title: Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research Volume: 18 Pages: 145-151
  • DOI: 10.1016/j.coemr.2021.03.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epigenome reprogramming in the male and female germ line (2021)
  • Author(s): Kurimoto Kazuki、Ikeda Hiroki、Kobayashi Hisato
  • Journal Title: Epigenetics and Reproductive Health Volume: 21 Pages: 3-25
  • DOI: 10.1016/b978-0-12-819753-0.00001-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cyclosporin A and FGF signaling support the proliferation/survival of mouse primordial germ cell-like cells in vitro† (2020)
  • Author(s): Ohta Hiroshi、Yabuta Yukihiro、Kurimoto Kazuki、Nakamura Tomonori、Murase Yusuke、Yamamoto Takuya、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 104 Pages: 344-360
  • DOI: 10.1093/biolre/ioaa195
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 始原生殖細胞発生過程におけるDNAメチル化リプログラミング (2020)
  • Author(s): 栗本一基
  • Journal Title: 月刊 細胞 Volume: 52 Pages: 508-511
• [Journal Article] マウス卵母細胞運命決定機構の解明 (2020)
  • Author(s): 長岡 創、栗本一基、斎藤通紀
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 38 Pages: 1893-1896
• [Journal Article] Germline development in rat revealed by visualization and deletion of Prdm14 (2020)
  • Author(s): Kobayashi Toshihiro、Kobayashi Hisato、Goto Teppei、Takashima Tomoya、Oikawa Mami、Ikeda Hiroki、Terada Reiko、Yoshida Fumika、Sanbo Makoto、Nakauchi Hiromitsu、Kurimoto Kazuki、Hirabayashi Masumi
  • Journal Title: Development Volume: 147 Pages: 183798-183798
  • DOI: 10.1242/dev.183798
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ZGLP1 is a determinant for the oogenic fate in mice (2020)
  • Author(s): Nagaoka So I.、Nakaki Fumio、Miyauchi Hidetaka、Nosaka Yoshiaki、Ohta Hiroshi、Yabuta Yukihiro、Kurimoto Kazuki、Hayashi Katsuhiko、Nakamura Tomonori、Yamamoto Takuya、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Science Volume: 367 Pages: 1089-1089
  • DOI: 10.1126/science.aaw4115
  • NAID: 120006850276
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Germ cell reprogramming (2019)
  • Author(s): Kurimoto Kazuki、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Current Topics in Developmental Biology Volume: 125 Pages: 91-125
  • DOI: 10.1016/bs.ctdb.2019.04.005
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 始原生殖細胞の発生とエピゲノムリプログラミング (2021)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 第126回日本解剖学会総会・全国学術集会・第98回日本生理学会大会
  • Invited
• [Presentation] 組織学にリンクした定量的な単一細胞遺伝子発現解析法の開発に向けて (2019)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Invited
• [Presentation] 単一細胞遺伝子発現解析の展望 (2019)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 「生体5次元情報」を解読する医工計測技術を創出する「知・もの・人」づくり計画キックオフシンポジウム
  • Invited