組織学的情報とリンクした単一細胞遺伝子発現プロファイル動態の解明

• Project Area: Ensuring integrity in gametogenesis
• Project/Area Number: 18H05553
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥120,770,000 (Direct Cost: ¥92,900,000、Indirect Cost: ¥27,870,000); Fiscal Year 2022: ¥19,240,000 (Direct Cost: ¥14,800,000、Indirect Cost: ¥4,440,000); Fiscal Year 2021: ¥23,270,000 (Direct Cost: ¥17,900,000、Indirect Cost: ¥5,370,000); Fiscal Year 2020: ¥22,620,000 (Direct Cost: ¥17,400,000、Indirect Cost: ¥5,220,000); Fiscal Year 2019: ¥24,050,000 (Direct Cost: ¥18,500,000、Indirect Cost: ¥5,550,000); Fiscal Year 2018: ¥31,590,000 (Direct Cost: ¥24,300,000、Indirect Cost: ¥7,290,000)
• Keywords: 1細胞解析 / LCM / 生殖細胞 / 組織 / 卵 / 配偶子形成 / シングルセル / 単一細胞 / トランスクリプトーム / 組織切片 / 形態 / gem cell / oocyte / histology / 単一細胞解析 / レーザーマイクロダイセクション / Single cell / 1細胞 / RNAseq / 組織学 / 単一細胞トランスクリプトーム / 配偶子 / 品質管理 / 卵子 / 位置情報

Outline of Annual Research Achievements

2021年度は凍結セルブロックを用いた条件検討を完了し、次世代シークエンサを用いた検証を行った。その結果、切片から採取した細胞と、新鮮なまま採取した細胞でほとんどそん色のないデータを得ることができることが分かった。さらに、エキソン-エキソンジャンクションについても新鮮なまま採取した細胞と同等のデータを得ることができ、切片から採取したことによってトランスクリプトーム解析の質をほとんど妥協する必要がないことが示唆された。この手法を特許出願した（特願2021-200053）。この結果は、我々が独自に開発した3'側へのバイアスのあるcDNA増幅法を用いて得られたものである。より広い応用を可能にするため、広く用いられ、mRNAの全長の解析も可能なcDNA増幅手法（Smart-seq2）や、市販のキット（タカラSmart-seq v4 kit）に適用可能なプロトコルを作成しつつある。この手法をマウス卵巣に適用し、卵母細胞や卵胞の顆粒層細胞の形態などの組織学的情報にリンクした定量的なトランスクリプトーム解析を行い、卵母細胞の形態からトランスクリプトームを高い精度で予測とアウトライヤーの検出、顆粒層細胞の組織学的な位置情報と遺伝子発現の差異など、生物学的に興味深い仮説を提示しうるデータを得た。また、スプライシング制御の卵胞成熟過程における重要性が指摘されているが、組織学的情報との関係を調べるために、エキソンジャンクションの解析を行い、既存のスプライスアイソフォームを定量的に検出可能であることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2020年度のRNase inhibitorの販売中止による問題は解決し、その後、予定通りに研究は進捗しているため。一方で、論文の査読で多くの批判がつきその対応を進行中であるため。

Strategy for Future Research Activity

前半期は現在投稿中の論文の査読対応を行う。また、マウス生殖巣において見出した現象の検証や、原始卵胞形成過程への適応など、生物学的な課題を解くための解析を行う。

Research Products

• [Journal Article] Reconstituting oogenesis in vitro: recent progress and future prospects (2021)
  • Author(s): Nagaoka So I.、Saitou Mitinori、Kurimoto Kazuki
  • Journal Title: Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research Volume: 18 Pages: 145-151
  • DOI: 10.1016/j.coemr.2021.03.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epigenome reprogramming in the male and female germ line (2021)
  • Author(s): Kurimoto Kazuki、Ikeda Hiroki、Kobayashi Hisato
  • Journal Title: Epigenetics and Reproductive Health Volume: 21 Pages: 3-25
  • DOI: 10.1016/b978-0-12-819753-0.00001-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cyclosporin A and FGF signaling support the proliferation/survival of mouse primordial germ cell-like cells in vitro† (2020)
  • Author(s): Ohta Hiroshi、Yabuta Yukihiro、Kurimoto Kazuki、Nakamura Tomonori、Murase Yusuke、Yamamoto Takuya、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 104 Issue: 2 Pages: 344-360
  • DOI: 10.1093/biolre/ioaa195
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 始原生殖細胞発生過程におけるDNAメチル化リプログラミング (2020)
  • Author(s): 栗本一基
  • Journal Title: 月刊 細胞 Volume: 52 Pages: 508-511
• [Journal Article] マウス卵母細胞運命決定機構の解明 (2020)
  • Author(s): 長岡 創、栗本一基、斎藤通紀
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 38 Pages: 1893-1896
• [Journal Article] Germline development in rat revealed by visualization and deletion of Prdm14 (2020)
  • Author(s): Kobayashi Toshihiro、Kobayashi Hisato、Goto Teppei、Takashima Tomoya、Oikawa Mami、Ikeda Hiroki、Terada Reiko、Yoshida Fumika、Sanbo Makoto、Nakauchi Hiromitsu、Kurimoto Kazuki、Hirabayashi Masumi
  • Journal Title: Development Volume: 147 Pages: 183798-183798
  • DOI: 10.1242/dev.183798
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ZGLP1 is a determinant for the oogenic fate in mice (2020)
  • Author(s): Nagaoka So I.、Nakaki Fumio、Miyauchi Hidetaka、Nosaka Yoshiaki、Ohta Hiroshi、Yabuta Yukihiro、Kurimoto Kazuki、Hayashi Katsuhiko、Nakamura Tomonori、Yamamoto Takuya、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Science Volume: 367 Issue: 6482 Pages: 4115-4115
  • DOI: 10.1126/science.aaw4115
  • NAID: 120006850276
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Germ cell reprogramming (2019)
  • Author(s): Kurimoto Kazuki、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Curr Top Dev Biol Volume: 125 Pages: 91-125
  • DOI: 10.1016/bs.ctdb.2019.04.005
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Single-cell RNA-sequencing for frozen sections with DRaqL; an efficient RNA recovery and cDNA amplification method for laser capture (2022)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 第127回日本解剖学会年会
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 始原生殖細胞の発生とエピゲノムリプログラミング (2021)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 第126回日本解剖学会総会・全国学術集会・第98回日本生理学会大会
  • Invited
• [Presentation] 組織学にリンクした定量的な単一細胞遺伝子発現解析法の開発に向けて (2019)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 日本分子生物学会
  • Invited
• [Presentation] 単一細胞遺伝子発現解析の展望 (2019)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 「生体5次元情報」を解読する医工計測技術を創出する「知・もの・人」づくり計画キックオフシンポジウム
  • Invited
• [Book] 疾患原因遺伝子・タンパク質の解析技術と創薬/診断技術への応用 (2022)
  • Author(s): 栗本一基
  • Total Pages: 13
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861048777
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞の溶解方法 (2022)
  • Inventor(s): 栗本一基、池田宏輝、宮尾晋太朗
  • Industrial Property Rights Holder: 奈良県立医科大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2021-200053
  • Filing Date: 2022