| Project Area | Multimode autophagy: Diverse pathways and selectivity |
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| Project/Area Number |
19H05706
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
小松 雅明 順天堂大学, 大学院医学研究科, 教授 (90356254)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和栗 聡 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (30244908)
杉浦 悠毅 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (30590202)
李 賢哲 順天堂大学, 医学部, 助教 (30758321)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥255,580,000 (Direct Cost: ¥196,600,000、Indirect Cost: ¥58,980,000)
Fiscal Year 2022: ¥57,330,000 (Direct Cost: ¥44,100,000、Indirect Cost: ¥13,230,000)
Fiscal Year 2021: ¥56,030,000 (Direct Cost: ¥43,100,000、Indirect Cost: ¥12,930,000)
Fiscal Year 2020: ¥55,640,000 (Direct Cost: ¥42,800,000、Indirect Cost: ¥12,840,000)
Fiscal Year 2019: ¥27,690,000 (Direct Cost: ¥21,300,000、Indirect Cost: ¥6,390,000)
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| Keywords | マルチモードオートファジー / オートファジー / マクロオートファジー / 選択的オートファジー / UFM1システム / 液ー液相分離 / p62 / 液－液相分離 / NCoR1 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究課題では、選択的マクロオートファジーの普遍的な分子機構に迫る。さらに、オートファジー欠損マウスや選択的オートファジー阻害マウスにおける基質タンパク質群の変動、その結果として起こる細胞生理機能の変化を検証し、個体における選択的マクロオートファジーの生理機能の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 選択的オートファジー基質の網羅的探索
オートファジー選択的基質p62液滴・ゲルの精製方法を開発した。また、p62結合タンパク質NBR1が細胞内のp62液滴形成を促進することも見出した。このNBR1の性質を利用し、効率よくp62液滴・ゲルを精製する方法を確立し、精製p62ゲルの質量分析を行った。また、選択的オートファジー不能となる新規遺伝子改変マウスを作製し、このマウス組織のプロテオーム解析を行った。
2. 新規オートファジー分解基質の解析
1.より選択的オートファジーにより分解される新規基質候補群を複数同定した。その中で、複数のタンパク質とRNAから構成される超分子複合体が新規基質であることを確かめた。オートファジーの薬理学的および遺伝学的阻害によりこの超分子複合体が蓄積することを確認した。選択的オートファジーには基質とLC3やGABARAPをはじめとしたオートファジー関連タンパク質（ATGタンパク質）を繋ぐアダプター分子が必要であり、主要なアダプター分子としてp62、NBR1、NDP52、OPTN、TAX1BP1が知られている。p62、NBR1, NDP52、OPTN、TAX1BP1の五重欠損細胞において本超分子複合体は顕著に蓄積しており、その蓄積はNBR1の発現により回復した。さらに、本超分子複合体の蓄積はNBR1単独欠損細胞においても確認された。
3. 選択的オートファジーによる生理的意義
オートファジー、あるいはATGタンパク質が脂肪滴生合成や分解に関与することが提唱されている。しかし、オートファジー欠損マウス肝臓では脂肪滴が蓄積するという報告と減少するという報告があり論争となっていた。オートファジーによる核内受容体コリプレッサーNCoR1分解が栄養飢餓や肝部分切除後に誘導される生理的脂肪肝に必要であることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
世界初の選択的オートファジー特異的阻害マウスの作製、そしてp62液滴・ゲル精製方法の確立、それら開発ツール・メソッドによる新規オートファジー基質群の同定を行った。今後、新規基質の詳細な解析により新しい選択的オートファジーの生理機能の知見が得られることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）新規選択的オートファジー基質群の解析
精製p62ゲルの質量分析や選択的オートファジー不能マウス組織のプロテオーム解析などから、オートファジー選択的基質候補群を同定した。選択的オートファジーの機能欠失モデル（選択的基質欠失あるいは選択的オートファジー不能培養細胞やマウス組織）を用いてRNA-seq、メタボロミクス、リピドミクス解析を行う。また、変動した遺伝子や代謝物から異常な代謝経路が見られる表現型を予測し、実際の解析を通して各種選択的オートファジーが担う生理的意義の解明を目指す。メタボロミクス、リピドミクス解析は研究分担者の杉浦、李が担当する。
（２）選択的オートファジーの分子制御
p62液滴・ゲルを大量に持つHuh-1細胞にGFP-p62およびCas-9を発現する細胞株を作製した。この細胞株では、p62液滴・ゲルはGFPによりラベルされる。GFP陽性-p62液滴・ゲルを指標にwhole genome sgRNAライブラリーを用いたスクリーニングを行い、新規選択的オートファジー制御因子の同定を行う。
（３）選択的オートファジー阻害マウスの開発と解析
国外共同研究者であるJin-A Lee博士（韓南大学）は、オートファゴソームに局在し選択的オートファジーに寄与するAtg8ファミリータンパク質に結合する人工プローブHyD-LIR(TP)を開発した（EMBO J, 2017）。このプローブを過剰発現させることで、オートファゴソーム形成には影響を与えず、選択的マクロオートファジーを各臓器で阻害できるマウスを開発した。このマウスを利用し、各組織（少なくとも、肝臓、脳）における選択的オートファジーの生理的意義を評価する。
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