DNAメチル化とH3K9me3の確立と維持の構造基盤
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
19H05741
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
有田 恭平 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (40549648)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥80,600,000 (Direct Cost: ¥62,000,000、Indirect Cost: ¥18,600,000)
Fiscal Year 2022: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2021: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000)
Fiscal Year 2020: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000)
Fiscal Year 2019: ¥22,620,000 (Direct Cost: ¥17,400,000、Indirect Cost: ¥5,220,000)
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| Keywords | DNAメチル化 / 構造生物学 / ユビキチン化 / ヒストン修飾 / DNA維持メチル化 / DNA複製 / クライオ電子顕微鏡 / クロマチン |
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| Outline of Research at the Start |
DNAメチル化やヒストンH3K9のメチル化（H3K9me3）は、クロマチンの構造変換を制御する遺伝子発現抑制的な非ゲノム情報である。これらの非ゲノム情報が発生・分化過程でどのように確立し、そして多細胞形質体を維持するために体細胞分裂後にどのように複製されていくのかは不明な点が多い。本研究では、非ゲノム情報による遺伝子発現抑制の確立と複製にかかる構造基盤として、ユビキチン化された複製因子PAF15とSETDB1によるDNA維持メチル化とH3K9me3の確立・複製に注目し、それぞれの分子機構を構造生物学的な観点から明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
非ゲノム情報であるDNAメチル化やヒストン修飾は、細胞の遺伝子発現パターンを規定し細胞形質を決定する。細胞が一度獲得した非ゲノム情報は個体の生涯を通して維持される。これにより哺乳類の多細胞形質は維持される。本研究では、遺伝子発現抑制的な非ゲノム情報であるDNAメチル化とH3K9me3の確立と維持機構に着目し、構造生物学的な研究を行う。
【項目1】DNAメチル化維持はDNAメチル化酵素DNMT1とそのリクルーターであるUHRF1が必須である。複製直後に起こる維持メチル化では、UHRF1は複製因子PAF15をユビキチン化し、これがDNMT1を複製サイトに呼び込む働きをする。この複製と連携した維持メチル化機構の解明のために複製因子とDNMT1の複合体のクライオ電子顕微鏡解析を行った。
【項目2】ヒストンH3K9メチル化酵素SETDB1はレトロトランスポゾンや組織特異的な遺伝子の発現抑制に寄与する。SETDB1のヒストンメチル化活性はユビキチン化により制御されるが、その活性化の分子機構は不明である。ユビキチン化によるSETDB1の活性化機構を構造生物的な観点から解明するために、大腸菌内共発現系を構築して均一にユビキチン化されたSETDB1の調製を試みた。
【その他】複製から遅れたDNA維持メチル化では、UHRF1によってヒストンH3がユビキチン化されDNMT1を呼び込む。この分子機構のクロマチンレベルでの理解は進んでいないので、ヌクレオソーム再構成と維持メチル化因子の相互作用解析と構造生物学的な研究に取り組んだ。本研究はDNA維持メチル化の包括的な理解につながる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【項目1】DNMT1を昆虫細胞で発現させ、高純度に精製した。均一にユビキチン化されたPAF15を調製するために、PAF15のユビキチン化されるリジン残基をシステイン残基に置換して、G76Cユビキチンとジスルフィド結合で連結させた（PAF15-Ub2）。DNAクランプとして働くPCNAはDNAと結合しないが、PAF15-Ub2存在下ではDNAと結合することをNative Gel Shift Assayで明らかにした。さらに、この3者複合体にDNMT1を加えてその複合体構造をクライオ電子顕微鏡で観察した。その結果、4者複合体からDNAが解離している分子が多いなどの問題点はあったが、DNMT1と考えられる粒子がPCNAの片側のみの存在していることがわかった。このことは、PAF15-Ub2によってDNMT1はPCNAの片側に集積し、新生鎖をメチル化する機構を反映していると考えられる。
【項目2】ユビキチン化に必要なE1, E2, ユビキチン遺伝子をコードした大腸菌内ユビキチン化ベクターをデザインした。これと、SETDB1を大腸菌内で共発現させSETDB1のユビキチン化に成功した。効率的にSETDB1をユビキチン化させる培養条件と精製方法の検討を現在行っている。
【その他】DNAメチル化やヒストン修飾のエピジェネティック修飾を導入したDNAやヒストンの精製を行った。さらに、塩透析法によりヌクレオソームの再構成を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
【項目1】複合体からDNAが解離する問題点の克服のために、化学架橋による複合体の安定化を行う。また、DNA：PCNA：DNAポリメラーゼの複合体では、DNA合成の反応を止めることで安定な3者複合体の構造解析に成功している。現在の4者複合体にさらにDNAポリメラーゼを加え、安定にDNAを結合させることを試みる。また、現状のユビキチン化PAF15は還元環境下で使用できないので、化学合成によるユビキチン化PAF15の調製を目指す。
【項目2】大腸菌ユビキチン化システムの最適化を行う。ユビキチン化SETDB1を精製し、ユビキチン化によるSETDB1の活性化をin vitroヒストンメチル化実験で確認する。また、立体構造解析に向けたユビキチン化SETDB1の精製法を確立する。
【その他】エピジェネティック修飾を導入したヌクレオソームと維持メチル化因子の複合体の調製を行い、クライオ電子顕微鏡解析によるモデル構築を行う。また、ユビキチン化などのより複雑な翻訳後修飾を導入したヌクレオソームの再構成を行う。
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Report
(2 results)
Research Products
(16 results)
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[Journal Article] Enhanced processivity of Dnmt1 by monoubiquitinated histone H32020
Author(s)
Y. Mishima, L. Brueckner, S. Takahashi, T. Kawakami, J. Otani, A. Shinohara, K. Takeshita, R. G. Garvilles, M. Watanabe, N. Sakai, H. Takeshima, C. Nachtegael, A. Nishiyama, M. Nakanishi, K. Arita, K. Nakashima, H. Hojo, I. Suetake
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Journal Title
Genes to Cells
Volume: 25
Pages: 22-32
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] The proper timing phosphorylation of Ser298 selects UHRF1-binding partners2020
Author(s)
Satomi Kori, Tomohiro Jimenji, Toru Ekimoto, Laure Ferry, Shohei Matano, Miwa Sato, Fumie Kusano, Motoko Unoki, Pierre-Antoine Defossez, Mitsunori Ikeguchi, Kyohei Arita
Organizer
第14回日本エピジェネティクス研究会年会
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