| Budget Amount *help |
¥80,600,000 (Direct Cost: ¥62,000,000、Indirect Cost: ¥18,600,000)
Fiscal Year 2023: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000)
Fiscal Year 2022: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2021: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000)
Fiscal Year 2020: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000)
Fiscal Year 2019: ¥22,620,000 (Direct Cost: ¥17,400,000、Indirect Cost: ¥5,220,000)
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【項目1】DNMT1を昆虫細胞で発現させ、高純度に精製した。均一にユビキチン化されたPAF15を調製するために、PAF15のユビキチン化されるリジン残基をシステイン残基に置換して、G76Cユビキチンとジスルフィド結合で連結させた（PAF15-Ub2）。DNAクランプとして働くPCNAはDNAと結合しないが、PAF15-Ub2存在下ではDNAと結合することをNative Gel Shift Assayで明らかにした。さらに、この3者複合体にDNMT1を加えてその複合体構造をクライオ電子顕微鏡で観察した。その結果、4者複合体からDNAが解離している分子が多いなどの問題点はあったが、DNMT1と考えられる粒子がPCNAの片側のみの存在していることがわかった。このことは、PAF15-Ub2によってDNMT1はPCNAの片側に集積し、新生鎖をメチル化する機構を反映していると考えられる。
【項目2】ユビキチン化に必要なE1, E2, ユビキチン遺伝子をコードした大腸菌内ユビキチン化ベクターをデザインした。これと、SETDB1を大腸菌内で共発現させSETDB1のユビキチン化に成功した。効率的にSETDB1をユビキチン化させる培養条件と精製方法の検討を現在行っている。
【その他】DNAメチル化やヒストン修飾のエピジェネティック修飾を導入したDNAやヒストンの精製を行った。さらに、塩透析法によりヌクレオソームの再構成を行った。
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