| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
19H05743
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
石黒 啓一郎 熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (30508114)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥88,010,000 (Direct Cost: ¥67,700,000、Indirect Cost: ¥20,310,000)
Fiscal Year 2022: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2021: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2020: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2019: ¥22,620,000 (Direct Cost: ¥17,400,000、Indirect Cost: ¥5,220,000)
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| Keywords | 減数分裂 / クロマチン / 生殖細胞 / 染色体 / ゲノム / エピゲノム / 複製 / エピジェネティクス |
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| Outline of Research at the Start |
生殖細胞では体細胞分裂から減数分裂への切り替えに伴って、減数分裂仕様に特化されたクロマチン構造の再構築が起きている。DNAメチル化、ヒストン修飾による半保存的に非ゲノム情報複製を行う体細胞とは対照的に、この再構築は減数分裂直前にむしろその構造を解消するように働くと推定される。本研究では、減数分裂期のクロマチン構造の解析を通して、生殖細胞系列と体細胞系列の非ゲノム情報複製に関わる様式の違いを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では体細胞分裂から減数分裂への切替えに働く新規の因子を同定した。MEIOSINと名付けたタンパク質はIDだけを付されたゲノムに眠る未解析遺伝子Gm4969にコードされていたが、HMG-likeドメインをもつDNA結合因子と推測された。MEIOSINを欠損させると精巣・卵巣の萎縮を伴って不妊となる。ChIP-seq解析の結果、MEIOSINは減数分裂関連遺伝子のプロモーター近傍に結合することが判明し、MEIOSINは減数分裂関連遺伝子を活性化する転写因子として働いていることが示唆された(Dev Cell 2020)。このMEIOSINの制御下に置かれている遺伝子群の中には、減数分裂を特徴付ける遺伝子が含まれることが、直接制御される標的遺伝子には多くの未解析のhypothetical geneが含まれることが判明している。
これらの未解析の遺伝子には、減数第一分裂に必要とされる未開拓の因子や体細胞型の細胞周期を積極的に抑制するものが含まれる可能性がある。まず、これらhypothetical geneについて、発現パターンの組織特異性を検討して精巣と卵巣に発現が限定される遺伝子を絞り込み、それらについて受精卵へのCRISPR-Cas9導入による遺伝子破壊を行い、8週齢F0個体の精巣が委縮を示すか否かを指標に表現型を解析した。なお効率良くスクリーニングを進める必要があるため、alleleの塩基配列の確認の手間を省くことができるように標的遺伝子座を大きく欠失させるssODN法を用いた。このスクリーニングにより選抜された複数の遺伝子についてさらに機能解析を進めており、既にいくつかについては成功している(Takemoto et al, Cell rep 2020)。またRAD21L型コヒーシンおよびREC8型コヒーシンと相互作用する共通の因子、それぞれにユニークな因子の同定を行い、減数分裂におけるクロマチン構造の解析を行った(Fujiwara et al., PLOS Genet. 2020)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
MEIOSIN標的遺伝子の一つで4930432K21rik について解析を行った。
4930432K21rikは特徴的なドメインを持たないため当初機能の推定が困難であった。しかしながら、4930432K21rik の抗体を作成し、精巣クロマチン分画からのIP-MS解析から減数分裂組換え因子(BRCA2, HSF2BP)やssDNA binding protein (RPA1)との相互作用が示唆された。さらに4930432K21rikは染色体の軸に沿ってfoci状の局在を示すことが判明した。さらにKOマウスの表現型解析から、4930432K21rikは減数分裂組換えの素過程でDSBによって露出されたssDNA末端に局在して、RAD51-BRCA2リコンビナーゼをリクルートすると同時にssDNA binding proteinをキックアウトする役割があることが判明した(Takemoto et al, Cell rep 2020)。
またさらに、MEIOSIN targetであるZFP541はmeiotic prophaseの後半から半数体のround spermatidで発現するZinc fingerドメインを持つタンパク質であることが判明した。Zfp541を欠損させると減数第一分裂以降のステージへの進行が見られず雄性不妊を示すことが明らかになり、減数第一分裂をexitする過程で必須の役割を担っていることが推定された。またこれと相互作用するKCTD19についても欠損マウスの解析を行って減数第一分裂をexitする過程で必要であることが判明した(Takada et al, bioRxiv 2021)。またRAD21L型コヒーシンおよびREC8型コヒーシンと相互作用する共通の因子、それぞれにユニークな因子の同定を行った。減数分裂型コヒーシンは相同染色体の対合のcheckを行うHORMAD1, HORMAD2と相互作用していること、さらにHORMAD1, HORMAD2はコヒーシン軸を足場にして、相同染色体の対合状態を監視していることが明らかとなった(Fujiwara et al., PLOS Genet. 2020).
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、CRISPR-Cas9導入による遺伝子破壊を行って、目視での観察が容易なF0世代のKO個体で精巣が委縮する表現型を示すことを指標にスクリーニングを行う。
精巣クロマチン分画からのIP-MS解析からZFP541はHDAC、KCTD19と相互作用することが判明している。この事実はZFP541が抑制性の転写制御に働くことを示唆する。またChIP-seq解析の解析からZFP541は多くの遺伝子のTSSに結合することがわかっている。KCTD19は精巣で特異的に発現する機能不明の未解析の因子であったが、クロマチンリモデリング因子によく見られるPOZ/BTBドメインをもつことからZFP541と相互作用して転写抑制に協調している可能性が示唆される。ZFP541によって制御される遺伝子群についてRNA-seq解析および既存のscRNA-seqデータ解析とを合わせて、減数分裂の完了に特徴的な遺伝子群を明らかにする。本研究はこれまでに先行研究が少ない減数分裂の遺伝子発現プログラムの終結について一石を投じる可能性が期待される。ZFP541-KCTD19-HDAC複合体による遺伝子発現制御と減数分裂脱出との関連を明らかにして公表を目指す。
またMEIOSINによって直接転写制御される標的の一つのFbx遺伝子についても解析をすすめる。これを欠損させると減数第一分裂前期の途中で染色体軸構造が早期に崩壊してしまい不妊を示す。F-boxドメインを持つことからSCFユビキチンリガーゼ複合体の基質認識サブユニットとして働いている可能性がある。減数第一分裂期に特有の染色体軸構造を崩壊に導く何らかのタンパク質分解制御が関与していることが示唆されるので、TurboID融合タンパクを発現するノックインマウスを作製し、この基質を同定してすることをゴールとして研究を進めている。
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