クロマチン複製における転写因子ネットワークの継承機構の解析

• Project Area: Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance
• Project/Area Number: 19H05748
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 丹羽 仁史 熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (80253730)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥100,490,000 (Direct Cost: ¥77,300,000、Indirect Cost: ¥23,190,000); Fiscal Year 2022: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2021: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2020: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2019: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
• Keywords: ES細胞 / 転写因子 / 転写因子ネットワーク / 細胞複製 / 細胞周期 / DNA複製

Outline of Research at the Start

本計画研究においては、新学術領域の連携を生かし、DNA 複製ならびに細胞分裂に伴い、転写因子はどのようにゲノムへの結合を回復し、転写因子ネットワーク活性を維持するのか、ないしはそれを遷移させ細胞を分化させるのか、鍵になる転写因子を同定し、その機能を明らかにすることを、（１）ゲノム複製と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析、（２）細胞分裂と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析、により目指すものである。

Outline of Annual Research Achievements

ゲノム複製と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析として、Repli ATAC-seq法の最適化を進め、EdUを用いたclick反応と、ATAC-seqを組み合わせるための条件を検討した。一方、細胞分裂と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析として、これまでに同定した新規mitotic bookmarker候補遺伝子Dppa2, Dppa4について、ES細胞の自己複製における機能解析を進めた。予期せぬことに、Dppa2欠損ES細胞とDppa4欠損ES細胞は、ともに長期継代により有意なテロメア長の短縮が認められた。これに古典的テロメラーゼ構成因子であるTertの欠損を加えると、さらにテロメア短縮が起こることから、Dppa2/4はテロメラーゼ非依存性にテロメア伸長に寄与することが示唆された。そこで、テロメア反復配列のガイドRNAを用いたenChIP (engineered DNA-binding molecule-mediated ChIP)法により、野生型ES細胞におけるテロメア結合タンパク質の質量分析を行ったところ、Dppa2, Dppa4のテロメア配列への結合は検出されなかった。そこで、この現象とM期染色体へのDppa2とDppa4の結合との関連を検討するため、間期とM期におけるDppa2の結合領域の比較を行うべく、特異抗体を用いたChIP-seq (CUT&RUN)の条件検討を進めた。一方、転写因子ネットワークモデルのvalidationとして、モデルが予想した重複ノックアウトES細胞の自己複製の可否を、ノックアウトES細胞を新たに作成することにより検証した。Klf2:Esrrb二重欠損とTbx３:Esrrb二重欠損について、それぞれES細胞を作成し、これらの欠損を持つES細胞がモデルの予想通りに自己複製できることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Repli ATAC-seq法の最適化は予定より時間を要したが、次年度には実施できるところまで検討を終えた。一方で、mitotic bookmarker候補として同定したDppa2, Dppa4については、これらがテロメア長維持に関与しているという、予期せぬ知見を得た。この発見は、これら因子が転写因子ネットワークの維持とは別の機能により、マウスES細胞の安定な複製に寄与している可能性を示唆しており、今後解析を継続する予定である。

Strategy for Future Research Activity

本計画は、ES細胞における転写因子ネットワークが細胞分裂に伴いどのようにして安定に娘細胞に継承されるのかを解析することを最終目標としている。しかし、上述のように、テロメア長の維持による長期にわたるES細胞の安定な複製を維持する機構につながる発見があり、今後は上記目標に加え、この分子機構についても解析を進める予定である。

Research Products

• [Journal Article] MEAF6 is essential for cell proliferation and plays a role in the assembly of KAT7 complexes (2020)
  • Author(s): Matsuura Kumi、Tani Naoki、Usuki Shingo、Torikai-Nishikawa Satomi、Okano Masaki、Niwa Hitoshi
  • Journal Title: Experimental Cell Research Volume: 396 Pages: 112279-112279
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2020.112279
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MEIOSIN directs the switch from mitosis to meiosis in mammalian germ cells (2020)
  • Author(s): Ishiguro K (Corresponding), Matsuura K, Tani N, Takeda N, Usuki S, Yamane M, Sugimoto M, Fujimura S, Hosokawa M, Chuma S, Ko S. H. M. Araki K, Niwa H
  • Journal Title: Developmental Cell Volume: 52 Issue: 4 Pages: 429-445
  • DOI: 10.1016/j.devcel.2020.01.010
  • Peer Reviewed