クロマチン複製における転写因子ネットワークの継承機構の解析

• Project Area: Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance
• Project/Area Number: 19H05748
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 丹羽 仁史 熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (80253730)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥100,490,000 (Direct Cost: ¥77,300,000、Indirect Cost: ¥23,190,000); Fiscal Year 2021: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2020: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2019: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
• Keywords: ES細胞 / 転写因子 / 転写因子ネットワーク / 細胞複製 / 細胞周期 / DNA複製

Outline of Research at the Start

本計画研究においては、新学術領域の連携を生かし、DNA 複製ならびに細胞分裂に伴い、転写因子はどのようにゲノムへの結合を回復し、転写因子ネットワーク活性を維持するのか、ないしはそれを遷移させ細胞を分化させるのか、鍵になる転写因子を同定し、その機能を明らかにすることを、（１）ゲノム複製と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析、（２）細胞分裂と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析、により目指すものである。

Outline of Annual Research Achievements

研究計画においては、DNA複製後の新生鎖における転写因子の標的ゲノム配列への結合の回復を評価する方法として、標識された新生鎖をATAC-seq法で解析する方法を提案したが、本法は最近他のグループからRepli-ATAC-seq法として報告された。現在、この方法のプロトコールの検証を進めるとともに、研究領域内の共同研究により、安価な自家製酵素を用いた実施法の最適化を進めている。M期染色体に結合する、mitotic bookmarkerの候補となる転写因子として、免疫染色法を用いた解析により、Utf1とDppa2/4を新たに同定した。そこで、これらの遺伝子について、Crispy/Cas9法により機能欠損ES細胞を作成した。また、細胞周期における転写因子ネットワーク複製効率を定量的に評価する系として、多能性関連転写因子ネットワークの鋭敏なマーカー遺伝子であるRex1/Zfp42遺伝子に、細胞周期マーカーtFucciをノックインしてその発現をモニターする方法を新たに考案した(Rex1-tFucci)。新たに作成したノックインベクターを野生型ES細胞に導入し、細胞株を作成したところ、これらの細胞では未分化状態特異的にtFucciの発現が確認された。また、そのCrispr/Cas9を併用した際の導入効率は極めて高く、これまでに樹立している各種変異型ES細胞株にも容易に導入可能であることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

repli-ATAC法が他のグループから報告されたことは、方法自体の新規性を損なうものではあったが、これを直ちに導入することにより、研究は順調に進展している。また、この点を補う方法論として、Rex1-tFucci法を開発した。

Strategy for Future Research Activity

研究計画の概要は変更することなく、研究を推進できるものと考えている。

Research Products

• [Journal Article] MEIOSIN directs the switch from mitosis to meiosis in mammalian germ cells (2020)
  • Author(s): Ishiguro K (Corresponding), Matsuura K, Tani N, Takeda N, Usuki S, Yamane M, Sugimoto M, Fujimura S, Hosokawa M, Chuma S, Ko S. H. M. Araki K, Niwa H
  • Journal Title: Developmental Cell Volume: 52 Issue: 4 Pages: 429-445
  • DOI: 10.1016/j.devcel.2020.01.010
  • Peer Reviewed