クロマチン複製における転写因子ネットワークの継承機構の解析

• Project Area: Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance
• Project/Area Number: 19H05748
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 丹羽 仁史 熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (80253730)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥100,490,000 (Direct Cost: ¥77,300,000、Indirect Cost: ¥23,190,000); Fiscal Year 2023: ¥20,540,000 (Direct Cost: ¥15,800,000、Indirect Cost: ¥4,740,000); Fiscal Year 2022: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2021: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2020: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2019: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
• Keywords: ES細胞 / 転写因子 / 転写因子ネットワーク / 細胞複製 / 細胞周期 / DNA複製

Outline of Research at the Start

本計画研究においては、新学術領域の連携を生かし、DNA 複製ならびに細胞分裂に伴い、転写因子はどのようにゲノムへの結合を回復し、転写因子ネットワーク活性を維持するのか、ないしはそれを遷移させ細胞を分化させるのか、鍵になる転写因子を同定し、その機能を明らかにすることを、（１）ゲノム複製と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析、（２）細胞分裂と転写因子ネットワーク活性をつなぐ分子機構の解析、により目指すものである。

Outline of Annual Research Achievements

DNA複製後の転写ネットーワークの再構築のKineticsを明らかにするため、EdU-plus/Thymidine-chase/ATAC-seqを組み合わせたrepli-ATAC-seq法を確立した。既報通り、DNA複製直後はエンハンサー領域のクロマチンアクセシビリティが大きく低下するが、複製後１時間で急速に回復することが分かった。次に、複製後のクロマチンアクセシビリティの急速な回復への転写因子Klfの機能的関与を調べるため、Klf2/4/5全欠損ES細胞の自己複製をKlf2あるいは他のナイーブ転写因子Nanog/Esrrb/Tbx3の強制発現によりレスキューした細胞株 (TKO+K2, TKO+NET)を用いて、ATAC-seqとrepli-ATAC-seqを行った。ATAC-seqデータ解析により、Klfを欠損したこれらの細胞株でエンハンサー領域におけるクロマチンアクセシビリティは定常時は大きな変化が無いことが分かった。一方、repli-ATAC-seqデータ解析により、TKO+K2細胞株ではDNA複製時のクロマチンアクセシビリティに大きな変化はないが、複製後1時間で起こるエンハンサー領域のクロマチンアクセシビリティの回復が顕著に遅れていることが分かった。これは他のKlf (Klf4/5)がDNA複製後の転写ネットーワークの再構築に寄
与する可能性を示唆している。さらに、TKO+NET細胞株ではrepli-ATAC-seq(Thymidine-chase無し)のシグナル自体が大きく低下していた。これがEdUの取り込み能力の低下によるのか、複製開始時のクロマチンアクセシビリティの低下によるのかについては今後の検討を必要とするが、Klf2/4/5がDNA複製開始にも何らかの機能を果たしている可能性が考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通りにrepli-ATACseq法の確立を行い、Klfファミリー転写因子が複製鎖における転写因子結合回復に寄与する可能性を見出した。

Strategy for Future Research Activity

repli-ATAC-seq法とrepli-CUT&Tag法を用いて、ゲノム複製後のオープンクロマチン構造およびRNAポリメラーゼ結合の回復のKineticsの解析を行う。またその回復過程における転写因子Klfの関与を明らかにするため、Klf2/4/5欠損ES細胞株を用いた解析を進める。また、転写因子Dppa2/4によるde novo DNAメチル化標的遺伝子（Germline遺伝子、2細胞期遺伝子制御転写因子Duxなど）のオープンクロマチン構造と転写の維持機構について、オーキシンデグロン法によりDppa2タンパクの即時欠損が可能なES細株等を活用して、M期におけるこれら転写因子の染色体への結合との関連を含めた解析を進める。さらに、Rex1-tFucciを導入したKlf2/Tbx3欠損ES細胞株を用いて、Klf2/Tbx3欠損によるナイーブ転写因子ネットワーク複製の効率への影響についての解析を進める。

Research Products

• [Journal Article] Meiosis-specific ZFP541 repressor complex promotes developmental progression of meiotic prophase towards completion during mouse spermatogenesis (2021)
  • Author(s): Horisawa-Takada Yuki et al.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 3184-3184
  • DOI: 10.1038/s41467-021-23378-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] MEAF6 is essential for cell proliferation and plays a role in the assembly of KAT7 complexes (2020)
  • Author(s): Matsuura Kumi、Tani Naoki、Usuki Shingo、Torikai-Nishikawa Satomi、Okano Masaki、Niwa Hitoshi
  • Journal Title: Experimental Cell Research Volume: 396 Issue: 1 Pages: 112279-112279
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2020.112279
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MEIOSIN directs the switch from mitosis to meiosis in mammalian germ cells (2020)
  • Author(s): Ishiguro K* (Corresponding), Matsuura K, Tani N, Takeda N, Usuki S, Yamane M, Sugimoto M, Fujimura S, Hosokawa M, Chuma S, Ko S.H.M, Araki K, Niwa H
  • Journal Title: Dev. Cell Volume: 52 Issue: 4 Pages: 429-445
  • DOI: 10.1016/j.devcel.2020.01.010
  • Peer Reviewed