| Project Area | Program of totipotency: From decoding to designing |
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| Project/Area Number |
19H05758
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
小倉 淳郎 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 室長 (20194524)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日野 敏昭 旭川医科大学, 医学部, 助教 (10550676)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥149,240,000 (Direct Cost: ¥114,800,000、Indirect Cost: ¥34,440,000)
Fiscal Year 2022: ¥28,080,000 (Direct Cost: ¥21,600,000、Indirect Cost: ¥6,480,000)
Fiscal Year 2021: ¥26,260,000 (Direct Cost: ¥20,200,000、Indirect Cost: ¥6,060,000)
Fiscal Year 2020: ¥26,260,000 (Direct Cost: ¥20,200,000、Indirect Cost: ¥6,060,000)
Fiscal Year 2019: ¥40,560,000 (Direct Cost: ¥31,200,000、Indirect Cost: ¥9,360,000)
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| Keywords | 全能性 / ゲノム再プログラム化 / 核移植クローン / 受精 / 胎盤 |
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| Outline of Research at the Start |
精子および卵子ゲノムは、受精により全能性を獲得する。この全能性の獲得には、卵子細胞質が大きく関わる。体細胞核移植は、その卵子細胞質中に存在する母性因子を利用して体細胞ゲノムに全能性を賦与する技術であるが、核移植クローン胚の多くは発生停止をしたり、あるいは生後の異常表現型を呈する。よって、正常な受精および体細胞核移植クローンにより得られた胚・胎仔・産子を詳細に解析することにより、完全な全能性獲得のための条件が明らかになると期待される。本研究では、発生工学的技術と最新のゲノム解析技術を駆使することにより、全能性獲得とその後の正常な発生・出生・成育に至るエピゲノム条件を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、核移植クローンを通じた全能性エピゲノムの理解を目指し、以下の２つの実験を行った。それぞれゲノム編集によりヘテロにノックアウトしたドナー細胞を用いた核移植により遺伝子発現を正常化したクローン胚を作出し、その発生能の解析および次世代シーケンサーなどを用いた全エピゲノム状態を調査した。
①母方ヘテロKOを用いてIG-DMRを正常化することにより、Dlk1 など複数のcoding遺伝子だけでなく、Mirg領域にある大規模なmicro(mi)RNA群の発現も正常化し、そのターゲット遺伝子も含めた多くの遺伝子の発現を正常化すると期待される。今年度、この IG-DMR を正常化したクローン胚のn数を増やし、解析を行ったが、クローン産子の出生率および胎盤形成の正常性は改善しなかった。その結果、IG-DMRのみでなく、その周囲におよびエピゲノム変化が生じていることが示唆された。実際に、この領域が関係すると思われる Placenta only の胎盤を解析したところ、父方母方にかかわらず、すべての遺伝子の発現が低下しており、IG-DMR を含む Dlk1-Dio3 領域全体がヘテロクロマチン化していることが示唆された。今後、このヘテロクロマチン化の原因および改善を試みる予定である。
②クローン胚では、H3K27me3依存性の胎盤特異的刷込み遺伝子でloss of imprinting (LOI)が生じ、両アレル性の発現（高発現）が生じていることが明らかになっっている。これまで解析したSfmbt2、Slc38a4、Gab1、Smoc1、およびSfmbt2内のmiRNAクラスターの計5つの遺伝子以外に残されていたSmoc1およびPhf17の母方KO を用いてクローンを行ったが、胎盤の表現型は変化がなかった。よって、この２遺伝子はクローン胎盤の異常には関係していないことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、クローン胚の発生に影響するエピジェネティクス異常としてH3K27me3の Loss of Imprintingによる Sfmbt2 miRNA の過剰発現（両アレル性発現）を同定し、その正常化によるクローン効率の向上および胎盤形成異常の改善に成功しており、論文化も行った。特にマウスクローンにおける胎盤形成異常（巨大化）は、最初の報告以来20年以上にわたる大きな謎であった。この少なくとも1つの原因を特定できたことは、今後の哺乳類のクローン技術の改善のみならず、本領域でも課題としている胎盤形成のエピジェネティクスの解明に貢献していくことと期待される。また、もう一つの謎である胎盤のみの発生 (placenta only）は、父方刷り込み領域である IG-DMR が関与していると推測されたが、IG-DMRのみでなく、それが支配する全領域（Dlk1-Dio3）がヘテロクロマチン化をしている傍証をえることができた。以上より、おおむね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに、核移植クローンを通じた全能性エピゲノムの理解を目指し、IG-DMRおよびH3K27me3依存性の胎盤特異的刷込み遺伝子の２つの研究を行ってきた。
前者については、IG-DMR DNAメチル化状態を正常化した後も、クローン産子の出生率および胎盤形成の正常性が改善せず、一方でIG-DMRが支配する全領域（Dlk1-Dio3）がヘテロクロマチン化をしている傍証をえることができたことから、この原因を明らかにし、改善することをめざす。
後者については、これまでにSfmbt2 miRNA の発現正常化によって胎盤の形成異常（巨大化）を改善させ、出生率も3％から7％へ改善し、さらに残りの遺伝子もほぼ解析が終わったことから、この課題はほぼ終了と考えている。一方、これらのcoding 遺伝子のうちSfmbt2やGab1 などでは、発現アレルである父方アレルを KO すると、補償的に母方アレルが発現する現象がある。これは通常の刷込み遺伝子にはみられない現象であるが、本年度は本格的に進めることができなかったので、今後、そのメカニズムを明らかにしたい。
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