Strctural and Functional Dynamics on Proteins Related to Biometal Dynamics

• Project Area: Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
• Project/Area Number: 19H05761
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 特任教授 (70183051)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 澤井 仁美 長崎大学, 工学研究科, 准教授 (50584851)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥80,210,000 (Direct Cost: ¥61,700,000、Indirect Cost: ¥18,510,000); Fiscal Year 2023: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2022: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000); Fiscal Year 2021: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2020: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2019: ¥19,500,000 (Direct Cost: ¥15,000,000、Indirect Cost: ¥4,500,000)
• Keywords: 生体鉄 / 構造ダイナミクス / 鉄トランスポーター / 鉄センサータンパク質 / 鉄還元酵素 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造機能解析 / ヘム鉄 / 鉄含有酵素 / 構造解析 / 鉄センサー

Outline of Research at the Start

生体にとって重要な鉄の輸送、感知、貯蔵、活用などの生命鉄動態は、様々なタンパク質によって制御されている。その制御が維持できなくなった時には生体は病気となる。この制御は細胞内という様々な生体物質が非常に密に存在する状況で、関連タンパク質同士の相互作用と各々のタンパク質の大きな構造の変化を伴っている。本研究では、時間分解測定の手法を用いて、ヒトと病原菌の生命鉄動態に関わるタンパク質（還元酵素、膜輸送体（トランスポーター）、センサータンパク質、酵素など）を研究対象とし、それらの機能時の動的な構造(構造ダイナミクス)と、それらの細胞内での機能を、分子構造を基に理解する。

Outline of Annual Research Achievements

ヒトの腸管上皮細胞での鉄動態（還元、吸収、輸送、貯蔵など）に関連する一連のタンパク質の構造と機能を基盤に、細胞内での鉄動態を分子から細胞のレベルで明らかにする事を目的としている。腸管上皮細胞のモデル細胞を構築するために、ヒト結腸ガン由来のCaco-2細胞に鉄還元酵素Dcytbを発現させた。食餌内に含まれると考えられる様々な有機酸、糖などの化合物を酸化鉄と共存させて、細胞内の鉄吸収を観察した結果、リンゴ酸とフルクトースが鉄吸収を促進させることがわかった。鉄、フルクトース存在下でのDcytb結晶作成を試みたが、鉄・フルクトース結合型の構造は得られなかった。
Dcytbにより還元された鉄（Fe2+）を腸管上皮細胞内に吸収する（膜輸送する）トランスポーターDMT1を、ハムスターCHO細胞の細胞膜に発現させることに成功し、ベシクル化によりそのDMT1含有の細胞膜を回収することが可能となった。
病原菌は自身の増殖に必要な鉄を得るために、宿主赤血球よりヘム（鉄ポルフィリン錯体）を奪取し取り込む。しかし、細胞内ヘムは過剰になると毒性を示すために、それを回避するためのヘム排出ポンプ（ヘムエクスポーター）を有する。その構造機能解析の研究結果を論文にまとめ投稿した（現在、rivise後の再査読中）。
鉄を活性中心に含むダイズ根粒菌の酸素センサータンパク質システムFixLJの動的構造と機能の関連を明らかにする目的で、FixJのin vitroおよびin cell NMR構造解析を行っている。今年度は詳細な構造情報を得るために常磁性ランタニドを導入したFixJを調製し、そのスペクトル測定に成功し、おおよその構造を得ることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Caco-2細胞を用いたヒト腸管上皮細胞をモデル細胞の構築は順調に進んでいる。Dcytbの発現とその細胞内での機能評価も可能となり、Dcytb変異体の発現もできている。Dcytbに関しては、分子レベルの研究と細胞レベルの研究を結びつけることが可能となりつつある。
DMT1は、大腸菌、酵母、昆虫細胞をホストとした発現系構築を試みてきたが、CHO細胞での発現に成功し、単離精製から構造機能解析による分子レベルでの研究推進の目処がたった。

Strategy for Future Research Activity

腸管上皮モデル細胞を用いてDcytbの構造機能研究を大きく展開する。変異体を用いて、鉄結合、分子内電子伝達、還元剤（アスコルビン酸）との相互作用などを検討する。また、構造柔軟性のためにX線結晶構造解析では構造を観測できなかったC末端の６０残基の役割を明らかにする。他のタンパク質との相互作用部位と期待している。さらに、このモデル細胞へのDMT1の発現も試み、細胞を用いたDMT1機能解析の準備をする。DMT1の分子構造を得るために、CHO細胞から作成したベシクルからの単離精製のプロトコールを確立する。
FixJのin vivo NMR構造解析の目処はたったので、in cell NMRのための準備を開始する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Ubiversity of Bristrol/University of Liverpool(英国)
• [Int'l Joint Research] University of Liverpool/University of Leeds(英国)
• [Journal Article] NO Dynamics in Microbial Denitrification System (2021)
  • Author(s): Tosha Takehiko、Yamagiwa Raika、Sawai Hitomi、Shiro Yoshitsugu
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 50 Issue: 2 Pages: 280-288
  • DOI: 10.1246/cl.200629
  • NAID: 130007986360
  • ISSN: 0366-7022, 1348-0715
  • Year and Date: 2021-02-05
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • Author(s): Kwon, H., Basran, J., Pathak, C., Hussain, M., Freeman, S. L., Fielding, A. J., Bailey, A. J., Stefanou, N., Sparkes, H. A., Tosha, T., Yamashita, K., Hirata, K., Murakami, H., Ueno, G., Ago, H., Tono, K., Yamamoto, M., Sawai, H., Shiro, Y., Sugimoto, H., Raven, E., Moody, P. C. E.
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: - Issue: 26 Pages: 14578-14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • Author(s): Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 118 Issue: 21
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Spatially restricted substrate-binding site of cortisol-synthesizing CYP11B1 limits multiple hydroxylations and hinders aldosterone synthesis (2021)
  • Author(s): Mukai Kuniaki、Sugimoto Hiroshi、Kamiya Katsumasa、Suzuki Reiko、Matsuura Tomomi、Hishiki Takako、Shimada Hideo、Shiro Yoshitsugu、Suematsu Makoto、Kagawa Norio
  • Journal Title: Current Research in Structural Biology Volume: 3 Pages: 192-205
  • DOI: 10.1016/j.crstbi.2021.08.001
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Regulatory Switching by Concerted Motions on the Microsecond Time Scale of the Oxygen Sensor Protein FixL (2021)
  • Author(s): Yamawaki Takeo、Mizuno Misao、Ishikawa Haruto、Takemura Kazuhiro、Kitao Akio、Shiro Yoshitsugu、Mizutani Yasuhisa
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 125 Issue: 25 Pages: 6847-6856
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c01885
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of membrane protein-lipid interactions on formation of bilayer lipid membranes on SAM-modified gold electrode (2021)
  • Author(s): Kato Masaru、Masuda Yuya、Yoshida Narumi、Tosha Takehiko、Shiro Yoshitsugu、Yagi Ichizo
  • Journal Title: Electrochimica Acta Volume: 373 Pages: 137888-137888
  • DOI: 10.1016/j.electacta.2021.137888
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • Author(s): Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Issue: 1 Pages: 467-467
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy (2020)
  • Author(s): Hanae Takeda, Tatsunari Kimura, Takashi Nomura, Masaki Horitani, Azusa Yokota, Akiko Matsubayashi, Shoko Ishii, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo and Takehiko Tosha
  • Journal Title: Bulletin of the Chemical Society of Japan Volume: 93 Issue: 7 Pages: 825-833
  • DOI: 10.1246/bcsj.20200038
  • NAID: 130007879554
  • ISSN: 0009-2673, 1348-0634
  • Year and Date: 2020-07-15
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The active form of quinol-dependent nitric oxide reductase from Neisseria meningitidis is a dimer (2020)
  • Author(s): Jamali M. Arif M.、Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Tosha Takehiko、Muramoto Kazumasa、Muench Stephen P.、Antonyuk Svetlana V.、Shiro Yoshitsugu、Hasnain Samar S.
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 7 Issue: 3 Pages: 404-415
  • DOI: 10.1107/s2052252520003656
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質・ヘム酵素の機能解明 (2020)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Journal Title: BJSCC Volume: 75 Pages: 51-56
  • NAID: 130007879402
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] UV Resonance Raman Characterization of a Substrate Bound to Human Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 (2019)
  • Author(s): Sachiko Yanagisawa , Kure’e Kayama , Masayuki Hara , Hiroshi Sugimoto , Yoshitsugu Shiro , Takashi Ogura
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 117 Issue: 4 Pages: 706-716
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.017
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dimeric structures of quinol-dependent nitric oxide reductases (qNORs) revealed by cryo-electron microscopy (2019)
  • Author(s): Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Chiduza George N.、Tosha Takehiko、Yamamoto Masaki、Shiro Yoshitsugu、Antonyuk Svetlana V.、Muench Stephen P.、Hasnain S. Samar
  • Journal Title: Science Advances Volume: 5 Issue: 8
  • DOI: 10.1126/sciadv.aax1803
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Chemomechanical Coupling in the Transport Cycle of a Type II ABC Transporter (2019)
  • Author(s): K. Tamura, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Sugita
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 123 Issue: 34 Pages: 7270-7281
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b04356
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Missing Piece of Two-Component Signal Transduction Systems Unveiled by SEC-SAXS (2019)
  • Author(s): H. Sawai, Y. Shiro
  • Journal Title: SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018 Volume: - Pages: 15-16
• [Journal Article] Observation of Enzymatic Reactions by Time-resolved X-ray Crystallography Using Photosensitive Caged Substrate (2019)
  • Author(s): T. Tosha, M. Kubo
  • Journal Title: SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018 Volume: - Pages: 28-29
• [Presentation] 鉄の生体内動態の分子科学 (2022)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 第２回レドックスR&D戦略委員会 春のシンポジウム 最先端技術が切り拓くレドックスバイオロジー
  • Invited
• [Presentation] Structural Basis for the Multifunctionality of the Heme-responsive Sensor Protein for Heme Detoxification in Hemolytic Bacteria (2021)
  • Author(s): H. Sawai
  • Organizer: 11th International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (ICPP-11)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural Insights into the Multifunctionality of the Heme-responsive Sensor Protein for Detoxification in Hemolytic Bacteria (2021)
  • Author(s): H. Sawai
  • Organizer: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2021 (Pacifichem 2021)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明：生命金属科学への展開をめざして (2021)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 鉄イオンの吸収に関わる膜タンパク質の構造と腸管モデル細胞を用いた機能解析 (2021)
  • Author(s): 澤井仁美
  • Organizer: 第１回トランスポーター研究会関西部会
  • Invited
• [Presentation] ヘムABCトランスポーターの基質輸送機構に関する分光学的解析 (2021)
  • Author(s): 木村哲就, 浅田拓也, 仲絢香, 林沙英, 城宜嗣, 杉本宏
  • Organizer: 第47回生体分子科学討論会
• [Presentation] ナノディスク再構成型BhuUV-Tによる段階的な基質輸送の分光学的観察 (2021)
  • Author(s): 木村哲就, 浅田拓也, 林沙英, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏
  • Organizer: 第21回蛋白質科学会年会
• [Presentation] Structural Analyses of ABC Transporters in Nucleotide Bound States Investigated by CW-ESR Spectroscopy (2021)
  • Author(s): 仲絢香、小堀康博、鍔木基成、城宜嗣、杉本宏、木村哲就
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] 酸素バリア性フィルムを用いた嫌気条件下での一酸化窒素還元酵素反応中間体の構造解析への挑戦 (2021)
  • Author(s): 榛葉幹治、松浦滉明、平田邦生、山本雅貴、城宜嗣、當舎武彦
  • Organizer: 第47回生体分子科学討論会
• [Presentation] ヒト腸管細胞モデル系を用いた鉄イオンの吸収を向上させる食品成分の探索とそれらの成分が鉄輸送関連タンパク質に作用する分子機構 (2021)
  • Author(s): 髙原教代、杉本宏、神戸大朋、城宜嗣、澤井仁美
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
• [Presentation] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明：Functional Studies of Iron-Related Proteins on Molecular Basis (2021)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 日本化学会第１０１春季年会
• [Presentation] 『生命金属科学』のめざすところ (2020)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: CSJ化学フェスタ
• [Presentation] Dynamics of Nitric Oxide in Bacterial Cellular Systems: NO Generation and Decomposition (2019)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: Japan-BIOCEV Symposium: Macromolecules; Structure, Function and Beyond
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Dynamics of Nitric Oxide in Cellular Systems: NO Generation and Decomposition (2019)
  • Author(s): Shiro Y.
  • Organizer: KTJ Bioinorganic Chemistry Symposium 2019 (KTJ-BICS 2019)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質の機能解明～生命金属科学への展開をめざして～ (2019)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 錯体化学会第69回討論会
  • Invited
• [Presentation] ヘム蛋白質の機能を司る構造・ダイナミクスとエネルギー流：実験と理論 (2019)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Elucidation of NO Reduction Mechanism in Soluble NO Reductase by Time-Resolved Crystallography with Photosensitive Caged Compound (2019)
  • Author(s): T. Tosha
  • Organizer: 32nd European Crystallographic Meeting (ECM32),
  • Invited
• [Presentation] 原子から細胞レベルの研究による鉄イオンの吸収メカニズムの理解と有効な鉄栄養強化食品成分の探索 (2019)
  • Author(s): 澤井仁美
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] 病原菌の鉄獲得システムで機能するヘムセンサー蛋白質の多機能性とその構造的機序 (2019)
  • Author(s): 澤井仁美
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会／第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
  • Invited
• [Book] 生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御 (2021)
  • Author(s): 城 宜嗣・津本浩平
  • Total Pages: 511
  • Publisher: NTS
  • ISBN: 9784860437060
• [Remarks] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html
• [Remarks] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞膜超分子複合体機能解析学講座
  • URL: http://www2.riken.jp/biometal/index.htm
• [Remarks] 兵庫県立大大学院生命理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html