Strctural and Functional Dynamics on Proteins Related to Biometal Dynamics

• Project Area: Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
• Project/Area Number: 19H05761
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (70183051)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 澤井 仁美 兵庫県立大学, 理学研究科, 助教 (50584851)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥80,210,000 (Direct Cost: ¥61,700,000、Indirect Cost: ¥18,510,000); Fiscal Year 2022: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000); Fiscal Year 2021: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2020: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2019: ¥19,500,000 (Direct Cost: ¥15,000,000、Indirect Cost: ¥4,500,000)
• Keywords: 生体鉄 / 構造ダイナミクス / 鉄トランスポーター / 鉄センサータンパク質 / 鉄還元酵素 / 鉄含有酵素 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造解析 / ヘム鉄 / 鉄センサー

Outline of Research at the Start

生体にとって重要な鉄の輸送、感知、貯蔵、活用などの生命鉄動態は、様々なタンパク質によって制御されている。その制御が維持できなくなった時には生体は病気となる。この制御は細胞内という様々な生体物質が非常に密に存在する状況で、関連タンパク質同士の相互作用と各々のタンパク質の大きな構造の変化を伴っている。本研究では、時間分解測定の手法を用いて、ヒトと病原菌の生命鉄動態に関わるタンパク質（還元酵素、膜輸送体（トランスポーター）、センサータンパク質、酵素など）を研究対象とし、それらの機能時の動的な構造(構造ダイナミクス)と、それらの細胞内での機能を、分子構造を基に理解する。

Outline of Annual Research Achievements

１．へムを活性中心に含む根粒菌の酸素センサータンパク質FixL/FixJシステムを研究対象に構造機能解析を行った。昨年度明かにしたFixLの酸素センサードメイン（TandemPASdomain）の結晶構造を基盤に、分子内シグナル伝達機構を明らかにするために、いくつかの変異体を作製しそれらの自己リン酸化活性を測定した。また、FixJ全長の溶液構造と細胞内での構造の差異を明らかにするために、変異により常磁性金属の結合部位を導入した。
２．病原菌のヘムセンサータンパク質PefRの研究成果を論文として報告した。
３．病原菌の鉄取込みポンプ（インポーター）の溶液構造解析（低温電子顕微鏡（クライオEM））を高い分解能で成功させる目的で、anphipholeによる可溶化を試みた。その試料の構造解析には成功したが、まだ分解能は低かった。
４．ヒトの小腸での鉄吸収で重要な機能を果たしている鉄還元酵素（Dcytb）の結晶構造を基盤に、その機能を細胞内で評価するシステムを構築している。ヒト腸管のモデル細胞であるCaco-2細胞の細胞膜にDcytbを発現させる事に成功し、この評価システムを用いて、様々な化合物そんざいかでの鉄取り込み効率を評価した。その結果、フルクトースが細胞への鉄取り込みを促進することを見出した。
５．また、Dcytbで還元された鉄を腸管細胞に取込む際に機能するトランスポーター（DMT1）の発現精製を開始した。当初は、大腸菌、酵母、昆虫細胞をホストとして用いたが成功しなかった。そこで、CHO細胞をホスト細胞としたところ、発現が確認できた。現在精製条件の検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１．FixL Tandem PAS domainの構造解析の結果を早急に報告する必要がある。全長FixJのNMR構造解析は順調に進んでいる。
２．病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのヘム感知機構を提案したが、ヘム結合後のPefRはミオグロビンなどと同様にヘムタンパク質として機能することがわかった。
３．ヘムインポータのクライオEM解析は、今は測定に適した試料を作成する目的で、ナノデスク作成の条件を検討中である。
４．ヒト小腸での鉄吸収を可視化するモデル細胞の構築は順調に進んでいる。CHO細胞を用いて鉄トランスポーター（DMT1）の発現を確認し、単離精製のプロトコールを検討中である。

Strategy for Future Research Activity

１．常磁性金属を活用して全長FixJのin vitro NMR構造解析を進める。同時に、in cell NMR測定の準備も進める。
２．ヘム結合型のヘムセンサータンパク質PefRの構造機能解析を進める。
３．病原菌のヘムインポーターのクライオEM用の試料を作成（ナノデスク）条件を確定させる。caged ATPを用いた時間分解分光測定を行う。
４．ヒト小腸での鉄吸収のモデル細胞の安定株を構築する。それを用いて、Dcytbの各種変異体の機能解析や鉄錯体のキレーターの評価を行う。Dcytbに加えてDMT1の発現も試み、ヒト小腸での鉄取込むの全体像の可視化をめざす。DMT1の単離精製法を確立し、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を開始する。DMT1とDcytbの複合体の結晶化を開始する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Liverpool/University of Leeds(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: University of Liverpool/University of Leeds
• [Journal Article] NO Dynamics in Microbial Denitrification System (2021)
  • Author(s): Tosha Takehiko、Yamagiwa Raika、Sawai Hitomi、Shiro Yoshitsugu
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 50 Pages: 280～288
  • DOI: 10.1246/cl.200629
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of membrane protein-lipid interactions on formation of bilayer lipid membranes on SAM-modified gold electrode (2021)
  • Author(s): Kato Masaru、Masuda Yuya、Yoshida Narumi、Tosha Takehiko、Shiro Yoshitsugu、Yagi Ichizo
  • Journal Title: Electrochimica Acta Volume: 373 Pages: 137888～137888
  • DOI: 10.1016/j.electacta.2021.137888
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • Author(s): Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Pages: 467
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The active form of quinol-dependent nitric oxide reductase from Neisseria meningitidis is a dimer (2020)
  • Author(s): Jamali M. Arif M.、Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Tosha Takehiko、Muramoto Kazumasa、Muench Stephen P.、Antonyuk Svetlana V.、Shiro Yoshitsugu、Hasnain Samar S.
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 7 Pages: 404～415
  • DOI: 10.1107/S2052252520003656
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy (2020)
  • Author(s): Takeda Hanae、Kimura Tetsunari、Nomura Takashi、Horitani Masaki、Yokota Azusa、Matsubayashi Akiko、Ishii Shoko、Shiro Yoshitsugu、Kubo Minoru、Tosha Takehiko
  • Journal Title: Bulletin of the Chemical Society of Japan Volume: 93 Pages: 825～833
  • DOI: 10.1246/bcsj.20200038
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質・ヘム酵素の機能解明 (2020)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Journal Title: BJSCC Volume: 75 Pages: 51-56
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] UV-Raman Characterization of a Substrate Tryptophan Bound to Human Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 (2019)
  • Author(s): S. Yanagisawa, K. Kayama, M. Hara, H. Sugimoto, Y. Shiro, T. Ogura
  • Journal Title: Biophys. J. Volume: 117 Pages: 706-716
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bpj.2019.07.017
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of Quinol-dependent Nitric Oxide Reductase from Alcaligenes xylosoxidans by Cryo-electron microscopy (2019)
  • Author(s): C. Gopalasingam, G. Chiduza, T. Tosha, M. Yamamoto, Y. Shiro, S. V. Antonyuk, S. Muench, S. S. Hasnain
  • Journal Title: Sci. Adv. Volume: 5 Pages: eaax1803
  • DOI: 10.1126/sciadv.aax1803
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Chemomechanical Coupling in the Transport Cycle of a Type II ABC Transporter (2019)
  • Author(s): K. Tamura, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Sugita
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 123 Pages: 7270-7281
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b04356
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Missing Piece of Two-Component Signal Transduction Systems Unveiled by SEC-SAXS (2019)
  • Author(s): H. Sawai, Y. Shiro
  • Journal Title: SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018 Volume: - Pages: 15-16
• [Journal Article] Observation of Enzymatic Reactions by Time-resolved X-ray Crystallography Using Photosensitive Caged Substrate (2019)
  • Author(s): T. Tosha, M. Kubo
  • Journal Title: SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018 Volume: - Pages: 28-29
• [Presentation] 分子構造を基盤にした鉄結合タンパク質の機能解明：Functional Studies of Iron-Related Proteins on Molecular Basis (2021)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 日本化学会第１０１春季年会
• [Presentation] 『生命金属科学』のめざすところ (2020)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: CSJ化学フェスタ
• [Presentation] Dynamics of Nitric Oxide in Bacterial Cellular Systems: NO Generation and Decomposition (2019)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: Japan-BIOCEV Symposium: Macromolecules; Structure, Function and Beyond
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Dynamics of Nitric Oxide in Cellular Systems: NO Generation and Decomposition (2019)
  • Author(s): Shiro Y.
  • Organizer: KTJ Bioinorganic Chemistry Symposium 2019 (KTJ-BICS 2019)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質の機能解明～生命金属科学への展開をめざして～ (2019)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 錯体化学会第69回討論会
  • Invited
• [Presentation] ヘム蛋白質の機能を司る構造・ダイナミクスとエネルギー流：実験と理論 (2019)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Elucidation of NO Reduction Mechanism in Soluble NO Reductase by Time-Resolved Crystallography with Photosensitive Caged Compound (2019)
  • Author(s): T. Tosha
  • Organizer: 32nd European Crystallographic Meeting (ECM32),
  • Invited
• [Presentation] 原子から細胞レベルの研究による鉄イオンの吸収メカニズムの理解と有効な鉄栄養強化食品成分の探索 (2019)
  • Author(s): 澤井仁美
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] 病原菌の鉄獲得システムで機能するヘムセンサー蛋白質の多機能性とその構造的機序 (2019)
  • Author(s): 澤井仁美
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会／第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
  • Invited
• [Book] 生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御 (2021)
  • Author(s): 城 宜嗣・津本浩平
  • Total Pages: 511
  • Publisher: NTS
  • ISBN: 978-4-86043-706-0
• [Remarks] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html
• [Remarks] 兵庫県立大学大学院理学研究科細胞膜超分子複合体機能解析学講座
  • URL: http://www2.riken.jp/biometal/index.htm
• [Remarks] 兵庫県立大大学院生命理学研究科細胞制御Ⅱ講座
  • URL: https://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html