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Strctural and Functional Dynamics on Proteins Related to Biometal Dynamics

Planned Research

Project AreaIntegrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
Project/Area Number 19H05761
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionUniversity of Hyogo

Principal Investigator

城 宜嗣  兵庫県立大学, 理学研究科, 特任教授 (70183051)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 澤井 仁美  長崎大学, 工学研究科, 准教授 (50584851)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2024-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥80,210,000 (Direct Cost: ¥61,700,000、Indirect Cost: ¥18,510,000)
Fiscal Year 2023: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2022: ¥15,860,000 (Direct Cost: ¥12,200,000、Indirect Cost: ¥3,660,000)
Fiscal Year 2021: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2020: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000)
Fiscal Year 2019: ¥19,500,000 (Direct Cost: ¥15,000,000、Indirect Cost: ¥4,500,000)
Keywords生体鉄 / 構造ダイナミクス / 鉄トランスポーター / 鉄センサータンパク質 / 鉄還元酵素 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造機能解析 / ヘム鉄 / 鉄含有酵素 / 構造解析 / 鉄センサー
Outline of Research at the Start

生体にとって重要な鉄の輸送、感知、貯蔵、活用などの生命鉄動態は、様々なタンパク質によって制御されている。その制御が維持できなくなった時には生体は病気となる。この制御は細胞内という様々な生体物質が非常に密に存在する状況で、関連タンパク質同士の相互作用と各々のタンパク質の大きな構造の変化を伴っている。本研究では、時間分解測定の手法を用いて、ヒトと病原菌の生命鉄動態に関わるタンパク質(還元酵素、膜輸送体(トランスポーター)、センサータンパク質、酵素など)を研究対象とし、それらの機能時の動的な構造(構造ダイナミクス)と、それらの細胞内での機能を、分子構造を基に理解する。

Outline of Annual Research Achievements

ヒトの腸管上皮細胞での鉄動態(還元、吸収、輸送、貯蔵など)に関連する一連のタンパク質の構造と機能を基盤に、細胞内での鉄動態を分子から細胞のレベルで明らかにする事を目的としている。腸管上皮細胞のモデル細胞を構築するために、ヒト結腸ガン由来のCaco-2細胞に鉄還元酵素Dcytbを発現させた。食餌内に含まれると考えられる様々な有機酸、糖などの化合物を酸化鉄と共存させて、細胞内の鉄吸収を観察した結果、リンゴ酸とフルクトースが鉄吸収を促進させることがわかった。鉄、フルクトース存在下でのDcytb結晶作成を試みたが、鉄・フルクトース結合型の構造は得られなかった。
Dcytbにより還元された鉄(Fe2+)を腸管上皮細胞内に吸収する(膜輸送する)トランスポーターDMT1を、ハムスターCHO細胞の細胞膜に発現させることに成功し、ベシクル化によりそのDMT1含有の細胞膜を回収することが可能となった。
病原菌は自身の増殖に必要な鉄を得るために、宿主赤血球よりヘム(鉄ポルフィリン錯体)を奪取し取り込む。しかし、細胞内ヘムは過剰になると毒性を示すために、それを回避するためのヘム排出ポンプ(ヘムエクスポーター)を有する。その構造機能解析の研究結果を論文にまとめ投稿した(現在、rivise後の再査読中)。
鉄を活性中心に含むダイズ根粒菌の酸素センサータンパク質システムFixLJの動的構造と機能の関連を明らかにする目的で、FixJのin vitroおよびin cell NMR構造解析を行っている。今年度は詳細な構造情報を得るために常磁性ランタニドを導入したFixJを調製し、そのスペクトル測定に成功し、おおよその構造を得ることに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Caco-2細胞を用いたヒト腸管上皮細胞をモデル細胞の構築は順調に進んでいる。Dcytbの発現とその細胞内での機能評価も可能となり、Dcytb変異体の発現もできている。Dcytbに関しては、分子レベルの研究と細胞レベルの研究を結びつけることが可能となりつつある。
DMT1は、大腸菌、酵母、昆虫細胞をホストとした発現系構築を試みてきたが、CHO細胞での発現に成功し、単離精製から構造機能解析による分子レベルでの研究推進の目処がたった。

Strategy for Future Research Activity

腸管上皮モデル細胞を用いてDcytbの構造機能研究を大きく展開する。変異体を用いて、鉄結合、分子内電子伝達、還元剤(アスコルビン酸)との相互作用などを検討する。また、構造柔軟性のためにX線結晶構造解析では構造を観測できなかったC末端の60残基の役割を明らかにする。他のタンパク質との相互作用部位と期待している。さらに、このモデル細胞へのDMT1の発現も試み、細胞を用いたDMT1機能解析の準備をする。DMT1の分子構造を得るために、CHO細胞から作成したベシクルからの単離精製のプロトコールを確立する。
FixJのin vivo NMR構造解析の目処はたったので、in cell NMRのための準備を開始する。

Report

(3 results)
  • 2021 Annual Research Report
  • 2020 Annual Research Report
  • 2019 Annual Research Report

Research Products

(40 results)

All 2022 2021 2020 2019 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (15 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 13 results,  Open Access: 8 results) Presentation (19 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 12 results) Book (1 results) Remarks (3 results)

  • [Int'l Joint Research] Ubiversity of Bristrol/University of Liverpool(英国)

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    • Author(s)
      Tosha Takehiko、Yamagiwa Raika、Sawai Hitomi、Shiro Yoshitsugu
    • Journal Title

      Chemistry Letters

      Volume: 50 Issue: 2 Pages: 280-288

    • DOI

      10.1246/cl.200629

    • NAID

      130007986360

    • ISSN
      0366-7022, 1348-0715
    • Year and Date
      2021-02-05
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      Kwon, H., Basran, J., Pathak, C., Hussain, M., Freeman, S. L., Fielding, A. J., Bailey, A. J., Stefanou, N., Sparkes, H. A., Tosha, T., Yamashita, K., Hirata, K., Murakami, H., Ueno, G., Ago, H., Tono, K., Yamamoto, M., Sawai, H., Shiro, Y., Sugimoto, H., Raven, E., Moody, P. C. E.
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: - Issue: 26 Pages: 14578-14585

    • DOI

      10.1002/anie.202103010

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    • Author(s)
      Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y
    • Journal Title

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      Volume: 118 Issue: 21

    • DOI

      10.1073/pnas.2101481118

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      Mukai Kuniaki、Sugimoto Hiroshi、Kamiya Katsumasa、Suzuki Reiko、Matsuura Tomomi、Hishiki Takako、Shimada Hideo、Shiro Yoshitsugu、Suematsu Makoto、Kagawa Norio
    • Journal Title

      Current Research in Structural Biology

      Volume: 3 Pages: 192-205

    • DOI

      10.1016/j.crstbi.2021.08.001

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      Yamawaki Takeo、Mizuno Misao、Ishikawa Haruto、Takemura Kazuhiro、Kitao Akio、Shiro Yoshitsugu、Mizutani Yasuhisa
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      The Journal of Physical Chemistry B

      Volume: 125 Issue: 25 Pages: 6847-6856

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.1c01885

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      Kato Masaru、Masuda Yuya、Yoshida Narumi、Tosha Takehiko、Shiro Yoshitsugu、Yagi Ichizo
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      Electrochimica Acta

      Volume: 373 Pages: 137888-137888

    • DOI

      10.1016/j.electacta.2021.137888

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    • Author(s)
      Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
    • Journal Title

      Communications Biology

      Volume: 4 Issue: 1 Pages: 467-467

    • DOI

      10.1038/s42003-021-01987-5

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  • [Journal Article] Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy2020

    • Author(s)
      Hanae Takeda, Tatsunari Kimura, Takashi Nomura, Masaki Horitani, Azusa Yokota, Akiko Matsubayashi, Shoko Ishii, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo and Takehiko Tosha
    • Journal Title

      Bulletin of the Chemical Society of Japan

      Volume: 93 Issue: 7 Pages: 825-833

    • DOI

      10.1246/bcsj.20200038

    • NAID

      130007879554

    • ISSN
      0009-2673, 1348-0634
    • Year and Date
      2020-07-15
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  • [Journal Article] The active form of quinol-dependent nitric oxide reductase from Neisseria meningitidis is a dimer2020

    • Author(s)
      Jamali M. Arif M.、Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Tosha Takehiko、Muramoto Kazumasa、Muench Stephen P.、Antonyuk Svetlana V.、Shiro Yoshitsugu、Hasnain Samar S.
    • Journal Title

      IUCrJ

      Volume: 7 Issue: 3 Pages: 404-415

    • DOI

      10.1107/s2052252520003656

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  • [Journal Article] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質・ヘム酵素の機能解明2020

    • Author(s)
      城 宜嗣
    • Journal Title

      BJSCC

      Volume: 75 Pages: 51-56

    • NAID

      130007879402

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    • Author(s)
      Sachiko Yanagisawa , Kure’e Kayama , Masayuki Hara , Hiroshi Sugimoto , Yoshitsugu Shiro , Takashi Ogura
    • Journal Title

      Biophysical Journal

      Volume: 117 Issue: 4 Pages: 706-716

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2019.07.017

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    • Author(s)
      Gopalasingam Chai C.、Johnson Rachel M.、Chiduza George N.、Tosha Takehiko、Yamamoto Masaki、Shiro Yoshitsugu、Antonyuk Svetlana V.、Muench Stephen P.、Hasnain S. Samar
    • Journal Title

      Science Advances

      Volume: 5 Issue: 8

    • DOI

      10.1126/sciadv.aax1803

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    • Author(s)
      K. Tamura, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Sugita
    • Journal Title

      J. Phys. Chem. B

      Volume: 123 Issue: 34 Pages: 7270-7281

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.9b04356

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      H. Sawai, Y. Shiro
    • Journal Title

      SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018

      Volume: - Pages: 15-16

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      T. Tosha, M. Kubo
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      SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018

      Volume: - Pages: 28-29

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      城 宜嗣
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      Shiro Y.
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  • [Presentation] 分子構造を基盤にしたヘムタンパク質の機能解明~生命金属科学への展開をめざして~2019

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      城 宜嗣
    • Organizer
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      城 宜嗣
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  • [Book] 生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御2021

    • Author(s)
      城 宜嗣・津本浩平
    • Total Pages
      511
    • Publisher
      NTS
    • ISBN
      9784860437060
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Published: 2019-07-04   Modified: 2023-07-19  

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