生命金属動態を鍵反応とするセンサー分子システムの構築と生理機能制御

• Project Area: Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
• Project/Area Number: 19H05762
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 青野 重利 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(機構直轄研究施設), 生命創成探究センター, 教授 (60183729)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村木 則文 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 准教授 (20723828)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥67,730,000 (Direct Cost: ¥52,100,000、Indirect Cost: ¥15,630,000); Fiscal Year 2023: ¥11,960,000 (Direct Cost: ¥9,200,000、Indirect Cost: ¥2,760,000); Fiscal Year 2022: ¥12,610,000 (Direct Cost: ¥9,700,000、Indirect Cost: ¥2,910,000); Fiscal Year 2021: ¥12,090,000 (Direct Cost: ¥9,300,000、Indirect Cost: ¥2,790,000); Fiscal Year 2020: ¥12,610,000 (Direct Cost: ¥9,700,000、Indirect Cost: ¥2,910,000); Fiscal Year 2019: ¥18,460,000 (Direct Cost: ¥14,200,000、Indirect Cost: ¥4,260,000)
• Keywords: 生命金属 / センサータンパク質 / 鉄硫黄クラスター / ヘム / 金属タンパク質 / ヒドロゲナーゼ / ヘムタンパク質 / 走化性制御系 / 酸素センシング / 酸素センサータンパク質 / 走化性制御システム / シグナル伝達 / 生命金属動態 / 金属含有型センサータンパク質 / 水素センサータンパク質 / ニッケル-鉄二核金属錯体

Outline of Research at the Start

本研究では、遷移金属を構成要素とするセンサーモジュールを有したセンサータンパク質の生合成過程におけるセンサーモジュールの構築とタンパク質部分への組込みの詳細な分子機構を解明することにより、細胞内生命金属動態制御を鍵反応とするセンサー分子システムの構築原理を理解し、「生命金属科学研究基盤の構築」のための基礎的知見を得る。さらに、センサーモジュールによる気体分子センシングの動的過程、気体分子センシングにおいて誘起されるタンパク質構造変化・機能制御を各種分光学的測定、結晶構造解析、生化学・分子生物学的解析によって明らかにし、生命金属が制御する細胞内構造ダイナミクスと機能の解明を行う。

Outline of Annual Research Achievements

酸素に対する走化性制御系においてMCPタンパク質として機能するHemATは、ヘムをセンサーモジュールとして利用することにより、酸素を直接センシングする。本研究では、HemATによる酸素センシング、および酸素をシグナル分子とする走化性制御系におけるシグナル伝達の分子機構解明を目的として研究を行った。HemATの結晶構造解析に向けて、Bacillus smithii、Aeribacillus pallidus、Parageobacillus thermoglucosidasius由来のHemAT（それぞれ、BsmHemAT、ApHemAT、PtHemATと表記する）３種それぞれについて、全長型のサンプルを用い、それらの酸化型および酸素結合型での結晶化スクリーニングを行った。その結果、複数の結晶化条件において、酸化型PtHemATと酸素化型PtHemATの結晶を得ることに成功した。現在、初期スクリーニングにおいて結晶が得られた条件をもとに、結晶化条件の最適化を進めている
HemATは、シグナル伝達タンパク質であるCheA、CheWと安定な三者複合体を形成することが分かった。HemATによる酸素センシングから開始されるシグナル伝達反応プロセスおよび、その分子機構を理解するためには、HemAT/CheA/CheW複合体の構造情報が必要不可欠である。そこで本研究では、BsmHemATと、それに対応するCheA、CheWを用い、クライオ電子顕微鏡単粒子構造解析によるHemAT/CheA/CheW複合体の構造解析を行った。その結果、Topazでの学習の後、粒子拾い出しを行い、2D classificationを行ったところ、良好な収束が見られた。3D classificationと精密化によって、分解能7.36オングストロームでのクライオEM構造を得ることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、遷移金属を構成要素とするセンサーモジュールを有したセンサータンパク質の構造機能相関の解明および、それらの生合成過程におけるセンサーモジュールの構築とタンパク質部分への組込みの詳細な分子機構を解明することにより、細胞内生命金属動態制御を鍵反応とするセンサー分子システムの構築原理を解明することを目的とし研究を進めている。本年度の研究では、ヘムをセンサーモジュールとする酸素センサータンパク質HemAT、およびHemATとCheA、CheWから構成される酸素に対する走化性制御系の構造機能相関解明に取り組み、全長型HemATの構造情報を得るため、結晶化スクリーニングを実施した。その結果、Parageobacillus thermoglucosidasius由来のHemATを用い、酸化型および酸素化型の状態での結晶を得ることに成功し、現在、結晶化条件の最適化を進めている。これまでに全長型HemATの結晶構造は報告されておらず、本研究で初めて、その全長構造を明らかにすることができると考えている。また、クライオ電子顕微鏡単粒子構造解析によるHemAT/CheA/CheW複合体の構造解析を行い、分解能7.36 オングストロームでのクライオEM構造を得ることに成功した。本複合体は、酸素に対する走化性制御系において中心的な役割を果たしており、より高分解能でその構造を明らかにすることができれば、生体内シグナル伝達反応の分子機構解明に大きく寄与することが期待される。現在、より高分解能でのHemAT/CheA/CheW複合体の構造解析を目指し、各種条件検討を進めている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究では、酸素に対する走化性（Aerotaxis）制御系において、ヘムを酸素センサーモジュールとして利用している酸素センサータンパク質HemATを対象とし、酸素センシングならびにシグナル伝達反応の中心的な役割を果たすHemAT/CheA/CheW複合体の構造決定に向けて、X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析を併用して研究を進める。現在、いくつかの結晶化条件において全長型HemATの結晶を得ることに成功しているので、今後は結晶化条件の最適化を行い、高分解能でのX線結晶構造解析を実施する予定である。また、クライオ電子顕微鏡単粒子構造解析によるHemAT/CheA/CheW複合体の構造解析を行い、分解能7.36 オングストロームでのクライオEM構造を得ることに成功しているので、今後はより光分解能での構造解析を目指し、各種実験条件の検討を進める。
また、水素センサータンパク質生合成反応の分子機構解明を目的とした研究にも取り組む。今後は、水素センサータンパク質生合成に関与する一連のアクセサリータンパク質がどのような組合せ・順番で反応することによりセンサータンパク質が合成されるのかを明らかにするため、X線小角散乱、および結晶構造解析を用いたアクセサリータンパク質複合体の構造解析、アクセサリータンパク質から水素センサータンパク質へのセンサーモジュール輸送反応過程の解析を計画している。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structural analysis of aldoxime dehydratase from Bacillus sp. OxB-1: Importance of surface residues in optimization for crystallization (2022)
  • Author(s): Matsui Daisuke、Muraki Norifumi、Chen Ke、Mori Tomoya、Ingram Aaron A.、Oike Keiko、Groger Harald、Aono Shigetoshi、Asano Yasuhisa
  • Journal Title: Journal of Inorganic Biochemistry Volume: 230 Pages: 111770～111770
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2022.111770
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural Characterization of Y29F Mutant of Thermoglobin from a Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus (2021)
  • Author(s): Muraki Norifumi、Takeda Kouta、Nam Dayeon、Muraki Megumi、Aono Shigetoshi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 50 Pages: 603～606
  • DOI: 10.1246/cl.200879
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Use of a Ferritin L134P Mutant for the Facile Conjugation of Prussian Blue in the Apoferritin Cavity (2021)
  • Author(s): Ikenoue Yuta、Tahara Yuhei、Miyata Makoto、Nishioka Takanori、Aono Shigetoshi、Nakajima Hiroshi
  • Journal Title: Inorganic Chemistry Volume: 60 Pages: 4693～4704
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.0c03660
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • Author(s): Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Pages: 467
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural characterization of HypX responsible for CO biosynthesis in the maturation of NiFe-hydrogenase (2019)
  • Author(s): Norifumi Muraki, Kentaro Ishii, Susumu Uchiyama, Satoru G. Itoh, Hisashi Okumura, and Shigetoshi Aono
  • Journal Title: Commun. Biol. Volume: 2 Pages: 385 (12 pages)
  • DOI: 10.1038/s42003-019-0631-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis for heme transfer reaction in heme uptake machinery from Corynebacteria (2019)
  • Author(s): Norifumi Muraki, Chihiro Kitatsuji, Yasunomi Okamoto, Takeshi Uchida, Koichiro Ishimori, and Shigetoshi Aono
  • Journal Title: Chem. Commun. Volume: 55 Pages: 13864-13867
  • DOI: 10.1039/C9CC07369H
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Structure and Function of HtaA/HtaB from Corynecbacterium gluatamicum (2021)
  • Author(s): Norifumi Muraki, Shigetoshi Aono
  • Organizer: International Chemistry Congress of Pacific Basin Societies 2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Crystal structure of HypX responsible for CO biosynthesis for the assembly of the active site in NiFe-hydrogenase (2021)
  • Author(s): Norifumi Muraki, Shigetoshi Aono
  • Organizer: International Chemistry Congress of Pacific Basin Societies 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural basis for the heme transfer reaction in the novel bacterial heme uptake system (2021)
  • Author(s): Norifumi Muraki, Shigetoshi Aono
  • Organizer: International Chemistry Congress of Pacific Basin Societies 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ヘムをシグナル分子とする細胞内ヘム濃度制御の分子機構 (2021)
  • Author(s): 青野重利
  • Organizer: 第３２回日本微量元素学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] Bacillus sp. OxB-1由来アルドキシム脱水酵素の結晶構造解析 (2021)
  • Author(s): 村木則文、松井大亮、浅野泰久、青野重利
  • Organizer: 日本結晶学会2021年度年会
• [Presentation] NiFe型ヒドロゲナーゼの活性中心形成に必要なCO生合成反応の分子機構 (2021)
  • Author(s): 青野重利
  • Organizer: 日本農芸化学会大会2021
  • Invited
• [Presentation] 水素代謝酵素の活性中心に必須な一酸化炭素を生合成する分子機構 (2020)
  • Author(s): 村木則文
  • Organizer: 日本農芸化学会中部支部第１８８回例会
  • Invited
• [Presentation] ヘムが関与する生体内シグナルセンシングおよびシグナル伝達 (2019)
  • Author(s): 青野重利
  • Organizer: 同志社大学ナノ・バイオサイエンス研究センター 私大戦略「細胞自在操作のための分子化学技術の開発拠点形成」成果報告会
  • Invited
• [Presentation] NiFeヒドロゲナーゼの活性中心に必須なCOの生合成を担うHypXの構造基盤 (2019)
  • Author(s): 村木則文、青野重利
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会／第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
• [Presentation] 病原菌の鉄獲得システムで機能するヘムセンサー蛋白質の多機能性とその構造的機序 (2019)
  • Author(s): 西永惠、長井聖奈、村木則文、青野重利、杉本宏、城宜嗣、澤井仁美
  • Organizer: 第19回日本蛋白質科学会年会／第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
• [Presentation] ヒドロゲナーゼ成熟化において一酸化炭素生合成を担うHypXの結晶構造解析 (2019)
  • Author(s): 村木則文、青野重利
  • Organizer: 日本結晶学会年会
• [Presentation] Mechanism of CO biosynthesis for the maturation of [NiFe] hydrogenase revealed by crystal structure of HypX (2019)
  • Author(s): N. Muraki, S. Aono
  • Organizer: 15th International Symposium on Applied Bioinorganic Chemistry
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural basis for the assembly of the NiFe-dinuclear active site in [NiFe]-Hydrogenases (2019)
  • Author(s): S. Aono, N. Muraki
  • Organizer: 7th International Symposium on Metallomics
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural Characterization of HypX Responsible for CO Biosynthesis in the Maturation of [NiFe]-Hydrogenases (2019)
  • Author(s): S. Aono
  • Organizer: Frontier Bioorganization Forum 2019
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural analysis of HypX responsible for CO production in the maturation of a [NiFe]-hydrogenase (2019)
  • Author(s): N. Muraki, S. Aono
  • Organizer: 19th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (ICBIC-19)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural Characterization of HypX Responsible for CO Biosynthesis to assemble the active site of [NiFe]-Hydrogenase (2019)
  • Author(s): S. Aono
  • Organizer: 2019 Korea-Taiwan-Japan Biological Inorganic Chemistry Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited