Molecular Mechanism of Signal Transduction System Regulating Biometal Dynamics

• Project Area: Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
• Project/Area Number: 19H05769
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 石森 浩一郎 北海道大学, 理学研究院, 教授 (20192487)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥78,520,000 (Direct Cost: ¥60,400,000、Indirect Cost: ¥18,120,000); Fiscal Year 2023: ¥14,950,000 (Direct Cost: ¥11,500,000、Indirect Cost: ¥3,450,000); Fiscal Year 2022: ¥15,470,000 (Direct Cost: ¥11,900,000、Indirect Cost: ¥3,570,000); Fiscal Year 2021: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000); Fiscal Year 2020: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000); Fiscal Year 2019: ¥19,500,000 (Direct Cost: ¥15,000,000、Indirect Cost: ¥4,500,000)
• Keywords: 生命金属科学 / 細胞内鉄動態 / アミノレブリン酸合成酵素 / ヘム / シグナル伝達 / ヘム制御モチーフ / 鉄制御蛋白質 / 鉄応答要素 / 金属生命科学 / ヘムシャペロン

Outline of Research at the Start

本新学術領域における「生命金属科学研究基盤」の確立のため、本研究課題では、生命金属の中でも、生命維持のための種々の生理学的に重要な過程で様々な機能を果たしている鉄に注目し、鉄が関与する制御系を構成する蛋白質の機能解析及び相互作用解析を基盤として、そのヘムを介した細胞内鉄動態制御機構の解明を目指す。一方、研究項目A03の目的である有害金属の生体内動態と作用機序の解明については、細胞内の鉄動態制御機構が、種々の要因で「攪乱」されることにより、細胞がどのような応答をするのか、生化学的、細胞生物学的に解析することにより、必須金属である鉄が有害金属に変容する機構の解明を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

生命金属科学研究基盤の確立に向けての研究　昨年度に引き続きヘム生合成の鍵酵素アミノレブリン酸合成酵素（ALAS1）の機能発現制御機構と、細胞内鉄代謝制御機構における鉄制御蛋白質（IRP）の機能制御機構について、以下の研究を行う。
１．細胞内鉄代謝制御機構におけるIRPの機能制御機構解析　細胞内鉄濃度恒常性は、鉄の細胞内への取り込みや鉄を貯蔵する蛋白質を翻訳段階で制御するIRPによって維持されている。本研究課題により、このIRPの翻訳機能を制御するシグナル伝達因子として、ヘムが同定されたが、その結合部位については、アミノ酸変異によって部位が異なることが示唆され、野生型におけるヘム結合部位については確定させることができていなかった。今年度は公募班の岐阜薬科大学の平山が開発したヘム修飾プローブを適用することで、IRPのホモログ蛋白質の一つであるIRP1におけるヘム結合部位が、これまでもそのヘム結合が示唆されていたヘム結合モチーフ部位であると決定することができた。
２．鉄応答転写因子Furの新たな機能とその生物学的意義　多くのバクテリアに存在している鉄応答性転写因子Furは、細胞内で利用できる鉄量に応じて鉄取り込みなどの鉄代謝に関する蛋白質の転写制御を行うことで、細胞内鉄恒常性を維持している。しかし、コレラ菌のFurは、ニッケル代謝に関連する蛋白質群をコードしているnikオペロンを制御していることが見出され、その転写機能について、精製蛋白質を用いて検討したところ、ニッケルではなく鉄によって標的DNA配列であるFur boxへの結合が制御されることを見出した。さらに、このnikオペロンを構成する蛋白質の一つであるVC1098はヘムを結合し、その親和性はヘムを活性中心として結合する蛋白質に比べ低く、これまで未同定であったシトクロムc生合成におけるヘムシャペロンである可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題における主な課題の一つであった野生型IRPにおけるヘムの結合部位については、アミノ酸変異によってヘム結合部位が変化することから、これまでの手法では同定には至らず、新たなヘム結合部位の同定手法の確立が必要であった。本領域の公募班員である岐阜薬科大学の平山は、細胞内のヘムの局在を追跡するヘム追跡蛍光プローブを開発したが、このプローブがヘム結合部位と特異的に結合する特性を生かして、ヘム修飾部位のみをプローブとして利用したところ、野生型IRP1において、そのヘム結合部位を決定することができた。このヘム結合部位の同定は、本研究課題にとって大きな進展であり、次年度以降に実施予定であるヘムの結合による蛋白質部分の構造変化追跡の基礎的な情報を与える。
一方、当初予定していたヘム生合成における律速段階を触媒するALAS1におけるヘム結合の構造的、機能的意義の解析は、マウス由来の酵素についてその精製手法にいくつか問題点が見いだされ、その解決に時間を要し、当初より遅れたものの確立させることができた。
また、ニッケル代謝関連遺伝子群nikオペロンを制御するFurのヘムによる制御機構については、当初、論文発表できるまでの進展は期待していなかったが、実験計画が予想以上に進行した。さらに、ニッケル代謝遺伝子群と想定されたnikオペロンを構成する蛋白質の一つが、代表的なヘム蛋白質であるシトクロムcの生合成におけるヘムシャペロンの可能性が示されるなど、予想以上の成果が得られたと考えられる。以上、2021年度は、当初予定していたALAS1については実験計画が遅れているものの、IRPについては領域内連携研究によって大きな進展がみられ、またFurについては予想していなかった興味深い結果が得られたことから、全体としては、おおむね順調に進展していると判断する。

Strategy for Future Research Activity

本年度までの研究成果から、IRP1におけるヘム結合部位については、親和性の高いヘム結合部位は同定された。一方、これまでの研究から親和性の低いヘム結合部位の存在が示唆されていることから、次年度以降はヘムやヘム修飾プローブの添加量を変化させてうえで、そのヘム結合部位について検討し、IRP1のヘム結合部位に関して十分な情報を得ることを予定している。また、本年度でこのヘム修飾プローブを用いたヘム結合部位同定法が確立されたので、次年度以降はさらに複雑なヘム結合挙動を示すIRP2についてもこの手法の応用によって野生型におけるヘム結合部位の同定とその機能的意義を明らかにする。
IRPにおけるヘム結合部位の同定の目途が立ったことから、コロナウイルス感染防止等で十分に行えなかった学外での連携研究のうち、IRPのヘム結合による蛋白質部分の構造変化をネイティブ質量分析やX線小角散乱などを用いて検討する。
ALAS1についてはマウス由来の酵素についてその精製手法が確立できたので、ヘム結合による構造変化を分光学的、生化学的手法を用いて検討を行う。
さらに、これまでコロナウイルス感染防止等で十分に検討できていない細胞内の鉄動態の追跡について、放射線医学総合研究所の武田との連携研究による量子ナノビームによるバイオ・ケミカルイメージングを用いた測定についても予備実験等を予定している

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Buffalo(米国)
• [Int'l Joint Research] State University of New York - Buffalo(米国)
• [Int'l Joint Research] State University of New York - Buffalo(米国)
• [Journal Article] Radical transfer but not heme distal residues is essential for pH dependence of dye-decolorizing activity of peroxidase from Vibrio cholerae (2021)
  • Author(s): Uchida, T., Omura, I., Umetsu, S., Ishimori, K.
  • Journal Title: J. Inorg. Biochem. Volume: 219 Pages: 111422-111422
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2021.111422
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Conformational ensemble of a multidomain protein explored by Gd3+ electron paramagnetic resonance (2021)
  • Author(s): Saio, T., Hiramatsu, S., Asada, M., Nakagawa, H., Shimizu, K., Kumeta, H., Nakamura, T., Ishimori, K.
  • Journal Title: Biophys. J. Volume: 120 Issue: 15 Pages: 2943-2951
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2021.06.033
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Zinc-Dependent Oligomerization of Thermus thermophilus Trigger Factor Chaperone (2021)
  • Author(s): Zhu Haojie、Matsusaki Motonori、Sugawara Taiga、Ishimori Koichiro、Saio Tomohide
  • Journal Title: Biology Volume: 10 Issue: 11 Pages: 1106-1106
  • DOI: 10.3390/biology10111106
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Regulation of the expression of the nickel uptake system in Vibrio cholerae by iron and heme via ferric uptake regulator (Fur) (2021)
  • Author(s): Muranishi, K., Ishimori, K., Uchida, T.
  • Journal Title: J. Inorg. Biochem. Volume: 228 Pages: 111713-111713
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2022.111713
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mechanistic Insights into Heme-mediated Transcriptional Regulation via a Bacterial Manganese-binding Iron Regulator, Iron Response Regulator (Irr) (2020)
  • Author(s): Nam, D., Matsumoto, M., Uchida, T., O’Brian, M. R., Ishimori, K.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 295 Issue: 32 Pages: 11316-11325
  • DOI: 10.1074/jbc.ra119.011855
  • NAID: 120007126835
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Osmotic Pressure Effects Identify Dehydration upon Cytochrome c - Cytochrome c Oxidase Complex Formation Contributing to a Specific Electron Pathway Formation (2020)
  • Author(s): Sato, W., Hitaoka, S., Uchida, T., Shinzawa-Itoh, K., Yoshizawa, K., Yoshikawa, S., Ishimori, K.
  • Journal Title: Biochem. J. Volume: 印刷中 Issue: 8 Pages: 1565-1578
  • DOI: 10.1042/bcj20200023
  • NAID: 120007029079
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A single mutation converts Alr5027 from cyanobacteria Nostoc sp. PCC 7120 to a heme-binding protein with heme-degrading ability (2020)
  • Author(s): Dojun, N., Muranishi, K., Ishimori, K., Uchida, T.
  • Journal Title: J. Inorg. Biochem. Volume: 203 Pages: 110916-110916
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2019.110916
  • NAID: 120007168592
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Accelerating structural life science by paramagnetic lanthanide probe methods (2019)
  • Author(s): Saio Tomohide、Ishimori Koichiro
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects Volume: － Issue: 2 Pages: 129332-129332
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.018
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of conserved arginine in the heme distal site of HutZ from Vibrio cholerae in the heme degradation reaction (2019)
  • Author(s): Uchida, T., Dojun, N., Ota, K., Sekine, Y., Nakamura, Y., Umetsu, S., Ishimori, K.
  • Journal Title: Arch. Biochem. Biophys. Volume: 677 Pages: 108165-108165
  • DOI: 10.1016/j.abb.2019.108165
  • NAID: 120006941687
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for heme transfer reaction in heme uptake machinery from Corynebacteria (2019)
  • Author(s): Norifumi Muraki, Chihiro Kitatsuji, Yasunomi Okamoto, Takeshi Uchida, Koichiro Ishimori, and Shigetoshi Aono
  • Journal Title: Chem. Commun. Volume: 55 Issue: 92 Pages: 13864-13867
  • DOI: 10.1039/c9cc07369h
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヘム依存性転写因子Irrにおける転写制御機構 (2022)
  • Author(s): 南 多娟、北辻千展、松本優希、内田 毅、Mark R. O'Brian、石森浩一郎
  • Organizer: 第1回レドックスR&D戦略委員会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Structural and Functional Characterization of Manganese-Dependent Heme-Regulated Transcriptional Factor, Irr (2021)
  • Author(s): Ishimori, K.
  • Organizer: International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines-11
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Specific heme binding to heme-regulated proteins and its functional significance (2021)
  • Author(s): Ishimori, K.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural and Functional Characterization of Heme-Regulated Proteins in Iron Metabolism (2020)
  • Author(s): Ishimori, K.
  • Organizer: Biometals 2020
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Specific heme binding to iron regulatory proteins (IRPs) and its functional significance (2019)
  • Author(s): K. Ishimori
  • Organizer: 7th Georgian bay International Conference on Bioinorganic Chemistry
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Electron Transfer from Cytochrome c to Cytochrome c Oxidase: Contribution of Hydrophobic Interactions to Formation of “Breakwater” in Electron Pathway (2019)
  • Author(s): K. ishimori
  • Organizer: Korea-Taiwan-Japan Bioinorganic Chemistry Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Electron Transfer Mechanism in Cytochrome c - Cytochrome c Oxidase Complex (2019)
  • Author(s): K. ishimori
  • Organizer: 2nd University of Strasbourg - Hokkaido University PhD Student Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] 「生命金属ダイナミクス」第4章第3節 金属センシング (2021)
  • Author(s): 石森浩一郎
  • Total Pages: 13
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 9784860437060
• [Remarks] 発表論文からPickup
  • URL: http://wwwchem.sci.hokudai.ac.jp/~stchem/pickup/
• [Remarks] 発表論文からPickup
  • URL: https://wwwchem.sci.hokudai.ac.jp/~stchem/pickup/