In-cell NMR studies of metalloproteins
| Project Area | Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System |
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| Project/Area Number |
19H05773
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (80261147)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥78,130,000 (Direct Cost: ¥60,100,000、Indirect Cost: ¥18,030,000)
Fiscal Year 2021: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000)
Fiscal Year 2020: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000)
Fiscal Year 2019: ¥21,580,000 (Direct Cost: ¥16,600,000、Indirect Cost: ¥4,980,000)
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| Keywords | 金属結合タンパク質 / in-cell NMR / 溶液NMR / 常磁性NMR / 立体構造 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞内は多種多様な分子が高密度で存在する「分子クラウディング」状態である．金属結合タンパク質の動態についても，細胞内では，クラウディング環境特有の相互作用（排除体積効果・非特異的相互作用）に加え，様々な「生命金属」イオンとの結合や，機能発現に関わる他の因子との特異的相互作用により強い影響を受けていると予想される．
細胞試料を直接NMR測定するin-cell NMRは，生細胞中タンパク質の動態を原子分解能で解析可能な現存する唯一の手法である．本研究は，in-cell NMRを用いて，金属結合タンパク質が関与する生命現象のin situ解析を行うものである．
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| Outline of Annual Research Achievements |
金属結合タンパク質の細胞内動態については，クラウディング環境特有の相互作用（排除体積効果・非特異的相互作用）に加え，様々な「生命金属」イオンとの結合や，機能発現に関わる他の因子との特異的相互作用により強い影響を受けていると予想される．細胞試料を直接NMR測定するin-cell NMRは，生細胞内のタンパク質の動態を原子分解能で解析可能な現存する唯一の手法である。本研究では，金属結合タンパク質が関与する生命現象のin situ解析を行うことを目的とし，NMR解析手法の高度化を行うことを目的としている．
本研究では，以下の4つのテーマで要素技術の研究を行う．すなわち，(1)迅速で高感度な多次元NMR測定法，(2)情報科学を駆使した，自動NMRデータ解析と高精度自動立体構造解析法，(3)細胞試料のマイクロ培養技術，(4)複合体形成やドメイン間相対配置の解析に資する効率的なランタノイド標識法の開発である．今年度は特に(1)，(2)に注力して研究を行った．
「迅速で高感度な多次元NMR測定法」については，スパースに観測された多次元NMRデータに対する，圧縮センシング(CS, LASSO)を用いた新たな信号再構成法の開発を進めた．
「情報科学を駆使した自動NMRデータ解析と高精度自動立体構造解析法」については，自動解析プログラムFLYAについて，in-cell NMRなどのより難しいデータへの適応を可能とするための改良と最適化を進めた．また，ベイズ推定法を用いた新しい立体構造解析手法について，細胞内環境下の様々なタンパク質へ応用し，汎用的システムに拡張することを目指した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では，まず「生命金属科学研究基盤構築」として，in-cell NMR解析系の確立を，また「測定解析法の高度化」として，最先端の溶液NMR測定・解析手法，情報科学を用いたタンパク質の立体構造解析法などをさらに高度化することを計画し，これに従って2019年度の研究を進めた．
「迅速で高感度な多次元NMR測定法」については，測定点をスパースに設定し観測を行った多次元NMRデータに対するデータ処理法として，一般的なLASSOのL1ノルム正則化に加え，Total Variation項の導入と，各項の重みの自動推定を高速に行うアルゴリズムを実装することで最適化を試み，良好な結果を得た．
「情報科学を駆使した自動NMRデータ解析と高精度自動立体構造解析法」については，従来のCYANAが持つNOE情報の自動帰属のアルゴリズムを，ベイズ推定を用いた計算のステップにも導入し，より客観的で正確性の高い立体構造を得るようなシステムの構築を試みた．
これに加えて，常磁性NMRデータを用いて効率的に立体構造を算出する方法の研究や，新学術領域内の共同研究で開始した，金属結合タンパク質関連の試料のNMR解析などについても，一定の成果が見られた．
以上のことから，2019年度に計画していた研究の多くについては当初の計画に従って推移しており，また本新学術領域内の他の研究者の研究にも利用できる技術の開発も進んでいることから，本研究は全体としておおむね順調に進展していると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，計画の修正を適宜行いつつ研究を継続し，(1) in-cell NMRの手法開発と高度化，(2) in-cell NMRを用いた金属動態に関わるタンパク質の解析（実証研究），(3) in-cell NMRを用いた応用研究，ついて研究を進めていく．
(1)については，まず，圧縮センシング(CS, LASSO)を用いた手法を3次元，４次元NMRデータに適用可能なプログラムとして完成させる．より客観的で正確性の高い立体構造計算法の確立も行う．さらに，長時間のin-cell NMR解析を可能にするbioreactorシステムの改良を進めるとともに，植物培養細胞を用いた系の確立を行う．
(2)については，領域内の共同研究を通じて金属動態関連タンパク質に適用することで，前項で述べた手法の堅牢性を検証しつつ，実証研究を行っていく．
(3)については，in-cell NMRを，疾病原因遺伝子産物に対する阻害剤スクリーニングに用いる方法の開発を試みる．
以上に加えて，単離精製された試料のための溶液NMR手法についても，ニーズに合わせた開発研究を行うことで，測定解析法の高度化を推進していく．
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Report
(1 results)
Research Products
(14 results)
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[Journal Article] High resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells2019
Author(s)
Tanaka, T., Ikeya, T., Kamoshida, H., Suemoto, Y., Mishima, M., Shirakawa, M., Guentert, P., Ito, Y.
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Journal Title
Angewandte Chemie International Edition
Volume: in press
Pages: 1-6
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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