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Time-resolved XFEL crystallography and rational engineering of light-driven proteins

Planned

Project AreaNon-equilibrium-state molecular movies and their applications
Project/Area Number 19H05777
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

岩田 想  京都大学, 医学研究科, 教授 (60452330)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 野村 紀通  京都大学, 医学研究科, 准教授 (10314246)
近藤 美欧  大阪大学, 工学研究科, 准教授 (20619168)
草木迫 司  東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (80815316)
山下 恵太郎  東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (20721690)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2024-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help
¥123,630,000 (Direct Cost: ¥95,100,000、Indirect Cost: ¥28,530,000)
Fiscal Year 2022: ¥25,220,000 (Direct Cost: ¥19,400,000、Indirect Cost: ¥5,820,000)
Fiscal Year 2021: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000)
Fiscal Year 2020: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000)
Fiscal Year 2019: ¥28,210,000 (Direct Cost: ¥21,700,000、Indirect Cost: ¥6,510,000)
KeywordsX線自由電子レーザー / 構造ダイナミクス / 光遺伝学 / フォトクロミックタンパク質 / X線結晶構造解析 / チャネルロドプシン / 時分割X線結晶構造解析 / 膜タンパク質
Outline of Research at the Start

光動作タンパク質分子内部で起こっている光によって駆動される異性化反応の非平衡動的構造基盤を解明する。さらに自然界に「あるがまま」のタンパク質光異性化反応を単に精密四次元時空間計測するのみにとどまらず、光刺激で機能モードのオン/オフや機能強度を「思うがまま」に切換え可能な、非侵襲的生体内計測や医療に有用な人工分子を、時分割立体構造データに基づいて合理的にデザイン・創出できることをいくつかの代表例で検証する。

Outline of Annual Research Achievements

「光」は空間分布と時間の制御が比較的容易である上に、波長を自在に変えられるという特性を有する。したがって、光動作タンパク質はフェムト秒パルスレーザーを光源とするポンプ・プローブ法による時分割構造機能解析に好適な研究対象である。本研究ではまず、光応答性膜イオンチャネル(チャネルロドプシン)C1C2を対象としてフェムト秒パルスレーザーを光源とするポンプ・プローブ法による時分割構造計測(TR-SFX)を行い、レチナールの光異性化反応に伴うタンパク質分子骨格の動作原理を解明した。C1C2の結晶化に関しては、微結晶になるような新たな結晶化条件を探索する必要があった。約10,000条件を検討し、0.5%や1 mM単位での細かい検討を重ねて、C1C2の微結晶を得ることに成功した。X線自由電子レーザー施設SACLAにてTR-SFX実験を行い、励起光照射後50 μs, 1 ms後の構造変化を2.8 Å分解能で得ることに成功した。得られた構造を解析すると、50 μsでは異性化したATRが捻じれ、隣接するアミノ酸残基がATRにより押される動きが観測された。1 msではこれらの構造変化に加え、ATRが結合しているTMと押されたアミノ酸残基が属するTMの動きも観測された。これらのTMはイオンチャネルのゲート形成に関与しており、これらのTMが動くことでゲートが開き、開状態になることが示唆された。得られた構造変化の情報に基づき、TMの動きを阻害するような変異体を作成し、イオンチャネルとしての機能が変化するか実験を行った。その結果、チャネルの開閉時間が変化することが確認された。これらの結果から、C1C2は異性化したATRによるアミノ酸残基、ヘリックスの構造変化により基底状態から開状態に遷移することが明らかになった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

TR-SFXのモデル系として光応答性膜イオンチャネル(チャネルロドプシン)C1C2を対象として時分割構造計測を行い、レチナールの光異性化反応に伴うタンパク質分子骨格の動作原理が解明できた。この成果は国際的にも評価が高い学術誌であるeLife誌にて発表できたため、本年度の目標は概ね達成できていると自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

(1) SFX時分割構造解析に使用可能な人工金属錯体触媒分子を含む微結晶の作製:新学術分野開拓の意欲的な試みとして、光応答性金属錯体触媒―抗体複合体化による人工機能性分子の創出と時分割構造解析を実施する。金属錯体触媒の反応過程をSFX時分割構造解析に供するため、光増感剤と抗体タンパク質との複合体結晶を作製し、光刺激による反応起点の同期、ならびに溶媒含量が高い結晶中での反応進行が可能な実験系を新規に確立する。
(2)光で機能制御が可能な高機能人工タンパク質の合理的創出:上記の光動作タンパク質の非平衡動的構造基盤に基づき、細胞内シグナル伝達の人為制御や神経生理の非侵襲的解析に応用可能な高機能分子デバイスを合理的に創出する。本研究期間ではそのモデル系として、チャネルロドプシンC1C2のイオン選択性の改変、CRY2-蛍光タンパク質融合型二光子励起対応の細胞内シグナル伝達光操作ツール、Ace2N改変型FRET膜電位プローブをSFX時分割構造知見に基づき設計・高機能化する。
(3)光で反応制御が可能な人工金属錯体触媒分子のSFX時分割構造解析:(1)で作製した光応答性の金属錯体触媒―抗体―光増感剤複合体の微結晶を用いてSFX時分割結晶構造解析を実施する。反応中間体の構造を決定し、中間体の電子構造と触媒活性の間の相関について包括的に評価する。これらの研究を通じ、触媒活性を左右する決定的な因子を特定し、戦略的に人工触媒分子を構築するための革新的な原理を解明する。

Report

(1 results)
  • 2019 Annual Research Report

Research Products

(31 results)

All 2020 2019 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (14 results) (of which Int'l Joint Research: 9 results,  Peer Reviewed: 14 results,  Open Access: 8 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 14 results)

  • [Int'l Joint Research] University of Gothenburg(スウェーデン)

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      Umeda Rie、Satouh Yuhkoh、Takemoto Mizuki、Nakada-Nakura Yoshiko、Liu Kehong、Yokoyama Takeshi、Shirouzu Mikako、Iwata So、Nomura Norimichi、Sato Ken、Ikawa Masahito、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 11 Pages: 1606-1606

    • DOI

      10.1038/s41467-020-15459-7

    • NAID

      120006957458

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      Claesson Elin et al.
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      eLife

      Volume: 9

    • DOI

      10.7554/elife.53514

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      Wolff, A. M., Kubo, M. et al.
    • Journal Title

      IUCrJ

      Volume: 7 Pages: 306-323

    • DOI

      10.1107/s205225252000072x

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      Asada Hidetsugu、Inoue Asuka、Ngako Kadji Francois Marie、Hirata Kunio、Shiimura Yuki、Im Dohyun、Shimamura Tatsuro、Nomura Norimichi、Iwanari Hiroko、Hamakubo Takao、Kusano-Arai Osamu、Hisano Hiromi、Uemura Tomoko、Suno Chiyo、Aoki Junken、Iwata So
    • Journal Title

      Structure

      Volume: 28

    • DOI

      10.1016/j.str.2019.12.003

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      Ishchenko Andrii、Stauch Benjamin、Han Gye Won、Batyuk Alexander、Shiriaeva Anna、Li Chufeng、Zatsepin Nadia、Weierstall Uwe、Liu Wei、Nango Eriko、Nakane Takanori、Tanaka Rie、Tono Kensuke、Joti Yasumasa、Iwata So、Moraes Isabel、Gati Cornelius、Cherezov Vadim
    • Journal Title

      IUCrJ

      Volume: 6 Pages: 1106-1119

    • DOI

      10.1107/s2052252519013137

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      K.Katayama, K. Suzuki, R. Suno, H. Tsujimoto, S. Iwata, T. Kobayashi, H. Kandori*
    • Journal Title

      The Journal of Physical Chemistry Letters

      Volume: 10(22) Pages: 7270-7276

    • DOI

      10.1021/acs.jpclett.9b02942

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    • Author(s)
      Shimazu Yoshiaki、Tono Kensuke、Tanaka Tomoyuki、Yamanaka Yasuaki、Nakane Takanori、Mori Chihiro、Terakado Kimura Kanako、Fujiwara Takaaki、Sugahara Michihiro、Tanaka Rie、Doak R. Bruce、Shimamura Tatsuro、Iwata So、Nango Eriko、Yabashi Makina
    • Journal Title

      Journal of Applied Crystallography

      Volume: 52 Pages: 1280-1288

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      10.1107/s1600576719012846

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      Koiwai Kotaro et al.
    • Journal Title

      ACS Applied Bio Materials

      Volume: 2 Pages: 4941-4952

    • DOI

      10.1021/acsabm.9b00686

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      Sanchez Juan C.et al.
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      Structural Dynamics

      Volume: 6 Pages: 054701-054701

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      10.1063/1.5120527

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      Kinjo T., Terai K., Horita S., Nomura N., Sumiyama K., Togashi K., Iwata S., Matsuda M.
    • Journal Title

      Nature Methods

      Volume: 16 Pages: 1029-1036

    • DOI

      10.1038/s41592-019-0541-5

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      Wickstrand Cecilia、Nogly Przemyslaw、Nango Eriko、Iwata So、Standfuss J?rg、Neutze Richard
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      Annual Review of Biochemistry

      Volume: 88 Pages: 59-83

    • DOI

      10.1146/annurev-biochem-013118-111327

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      Kimura Kanako Terakado、Asada Hidetsugu、Inoue Asuka、Kadji Francois Marie Ngako、Im Dohyun、Mori Chihiro、Arakawa Takatoshi、Hirata Kunio、Nomura Yayoi、Nomura Norimichi、Aoki Junken、Iwata So、Shimamura Tatsuro
    • Journal Title

      Nature Structural and Molecular Biology

      Volume: 26 Pages: 121-128

    • DOI

      10.1038/s41594-018-0180-z

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      Toyoda Y, Morimoto K, Suno R, et al.
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      Nature chemical biology

      Volume: 15 Pages: 18-26

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      10.1038/s41589-018-0131-3

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      Morimoto K, Suno R, Hotta Y, Yamashita K, Hirata K, Yamamoto M, Narumiya S, Iwata S, Kobayashi T.
    • Journal Title

      Nature Chemical Biology

      Volume: 15(1) Pages: 8-10

    • DOI

      10.1038/s41589-018-0171-8

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URL: 

Published: 2019-07-04   Modified: 2022-07-01  

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