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Shooting Molecular Movies of Enzyme Reactions

Planned Research

Project AreaNon-equilibrium-state molecular movies and their applications
Project/Area Number 19H05780
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Complex systems
Research InstitutionTottori University

Principal Investigator

Nagano Shingo  鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 中津 亨  和歌山県立医科大学, 薬学部, 教授 (50293949)
溝端 栄一  大阪大学, 大学院工学研究科, 講師 (90571183)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2024-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥134,290,000 (Direct Cost: ¥103,300,000、Indirect Cost: ¥30,990,000)
Fiscal Year 2023: ¥23,920,000 (Direct Cost: ¥18,400,000、Indirect Cost: ¥5,520,000)
Fiscal Year 2022: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000)
Fiscal Year 2021: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
Fiscal Year 2020: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
Fiscal Year 2019: ¥35,490,000 (Direct Cost: ¥27,300,000、Indirect Cost: ¥8,190,000)
Keywords高速分子動画 / ディールスアルダー反応 / 発光タンパク質 / Rubisco / 2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ / RuBisCO / 酵素反応メカニズム / X線自由電子レーザー / 分子動画 / 酵素 / 結晶構造解析 / 反応メカニズム / 結晶構造 / 酵素反応 / メカニズム / XFEL / 微結晶 / 時分割X線結晶構造解析
Outline of Research at the Start

酵素が機能する仕組みを明らかにするためには、その反応が起こりつつある非平衡状態の反応場の構造を高い空間・時間分解能で解析することが必須である。本研究では、研究代表者と分担者らがすでに結晶構造を決定した分子内ディールスアルダー環化反応を行う酵素,光合成炭酸固定の鍵酵素Rubisco,および発光タンパク質イクオリンを対象に、南後班で開発する温度ジャンプ法や二液混合法など光トリガーに依存しない手法、および清中班と共同で開発する光作動性を付与したケージド基質を用いる手法を駆使して酵素反応を同期的に進行させ、酵素が基質を巧みに操り化学反応を進める過程を、高い時間・空間分解能で解析する。

Outline of Final Research Achievements

Research was conducted on various targets to visualize the reaction processes of enzymes and proteins as molecular movies. From the molecular dynamics simulations and the substrate-free crystal structures of Dieals-Alderases, Phm7 and Fsa2, we proposed a substrate binding mode that can explain the stereoselective reaction mechanism of the enzymes, and confirmed its accuracy with crystal structures of the methylated product-bound form of Fsa2. The order and position of the Ca2+ binding that induces the luminescence of Aequorin were also clarified. Furthermore, we determined the structure of the active and ligand-free form of Rubisco and showed that this structure is distinct from both the open and closed forms of the enzymes known so far.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

分子シミュレーションでは推定が困難なタンパク質・酵素の構造変化を実験的に捉えることは生命科学において今後ますます重要性を増す。本研究では,目標とした酵素反応の過程を可視化するには至らなかったものの,そのゴールに向けて乗り越えるべき課題,例えば試料調製やビームラインでの試料の取り扱い,時分割構造解析のデータ測定などを明らかにし,それらのいくつかについて乗り越えることができた。本研究で得られた技術と経験が今後のXFELを用いた時分割構造解析に向けた確かな礎となるであろう。

Report

(6 results)
  • 2023 Annual Research Report   Final Research Report ( PDF )
  • 2022 Annual Research Report
  • 2021 Annual Research Report
  • 2020 Annual Research Report
  • 2019 Annual Research Report
  • Research Products

    (89 results)

All 2024 2023 2022 2021 2020 2019 Other

All Journal Article (14 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 14 results,  Open Access: 11 results) Presentation (68 results) (of which Int'l Joint Research: 10 results,  Invited: 16 results) Book (3 results) Remarks (4 results)

  • [Journal Article] X-ray Crystallographic Analysis of Luciferase:oxyakalumine:AMP Complex2023

    • Author(s)
      中津 亨、田中 義明、加藤 博章
    • Journal Title

      SPring-8/SACLA Research Report

      Volume: 11 Issue: 5 Pages: 300-304

    • DOI

      10.18957/rr.11.5.300

    • ISSN
      2187-6886
    • Year and Date
      2023-10-31
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      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Elucidation of the stereocontrol mechanisms of the chemical and biosynthetic intramolecular Diels?Alder cycloaddition for the formation of bioactive decalins2023

    • Author(s)
      Kariya Takumi、Hasegawa Hayato、Udagawa Taro、Inada Yusaku、Nishiyama Kyoko、Tsuji Mieko、Hirayama Tasuku、Suzutani Tatsuo、Kato Naoki、Nagano Shingo、Nagasawa Hideko
    • Journal Title

      RSC Advances

      Volume: 13 Issue: 40 Pages: 27828-27838

    • DOI

      10.1039/d3ra04406h

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      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Rational design of an artificial ethylbenzene hydroxylase using a molecular dynamics simulation to enhance enantioselectivity2023

    • Author(s)
      Oohora Koji、Kagawa Yoshiyuki、Nishiura Takako、Mizohata Eiichi、Schwaneberg Ulrich、Hayashi Takashi
    • Journal Title

      Chemistry Letters

      Volume: 53 Issue: 2

    • DOI

      10.1093/chemle/upad042

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Anammox Bacterial S-Adenosyl-l-Methionine Dependent Methyltransferase Crystal Structure and Its Interaction with Acyl Carrier Proteins2023

    • Author(s)
      Uegaki Tesshin, Takei Taisei, Yamaguchi Shuhei, Fujiyama Keisuke, Sato Yusuke, Hino Tomoya, Nagano Shingo
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 24 Issue: 1 Pages: 744-744

    • DOI

      10.3390/ijms24010744

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] What Kind of Measurements Can Be Made with an X-ray Free Electron Laser at SACLA?2022

    • Author(s)
      Nakatsu Toru
    • Journal Title

      YAKUGAKU ZASSHI

      Volume: 142 Issue: 5 Pages: 479-485

    • DOI

      10.1248/yakushi.21-00203-1

    • ISSN
      0031-6903, 1347-5231
    • Year and Date
      2022-05-01
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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Functional diversity and plasticity in the sugar preferences of Saccharomyces MALT transporters in domesticated yeasts2022

    • Author(s)
      Hatanaka Haruyo, Toyonaga Hiromi, Ishida Yukiko, Mizohata Eiichi, Ono Eiichiro
    • Journal Title

      FEMS Yeast Research

      Volume: 22 Issue: 1

    • DOI

      10.1093/femsyr/foac055

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      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Substrate Specificity of an Aminopropyltransferase and the Biosynthesis Pathway of Polyamines in the Hyperthermophilic Crenarchaeon Pyrobaculum calidifontis2022

    • Author(s)
      Fukuda Wakao、Osaki Mamoru、Yasuda Yusuke、Hidese Ryota、Higuchi Tsunehiko、Umezawa Naoki、Fujiwara Shinsuke、Mizohata Eiichi
    • Journal Title

      Catalysts

      Volume: 12 Issue: 5 Pages: 567-567

    • DOI

      10.3390/catal12050567

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      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Crystal structures of a 6-dimethylallyltryptophan synthase, IptA: Insights into substrate tolerance and enhancement of prenyltransferase activity2022

    • Author(s)
      Hironori Suemune, Doukan Nishimura, Kenjiro Mizutani, Yusuke Sato, Tomoya Hino, Hiroshi Takagi, Yumi Shiozaki-Sato, Shunji Takahashi*, Shingo Nagano*
    • Journal Title

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      Volume: 593 Pages: 144-150

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2022.01.018

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structure of the adenylation domain from an ε-poly-l-lysine synthetase provides molecular mechanism for substrate specificity2022

    • Author(s)
      Takaki Okamoto, Kazuya Yamanaka, Yoshimitsu Hamano, Shingo Nagano, TomoyaHino*
    • Journal Title

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      Volume: 596 Pages: 43-48

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2022.01.053

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      2021 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Heavy Atom Detergent/Lipid Combined X-ray Crystallography for Elucidating the Structure-Function Relationships of Membrane Proteins2021

    • Author(s)
      Shinya Hanashima, Takanori Nakane, Eiichi Mizohata*
    • Journal Title

      Membranes (Basel)

      Volume: 11(11) Issue: 11 Pages: 823-823

    • DOI

      10.3390/membranes11110823

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      2021 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Molecular Basis for Two Stereoselective Diels-Alderases that Produce Decalin Skeletons2021

    • Author(s)
      Fujiyama Keisuke、Kato Naoki、Re Suyong、Kinugasa Kiyomi、Watanabe Kohei、Takita Ryo、Nogawa Toshihiko、Hino Tomoya、Osada Hiroyuki、Sugita Yuji、Takahashi Shunji、Nagano Shingo
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 60 Issue: 41 Pages: 22401-22410

    • DOI

      10.1002/anie.202106186

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    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] The crystal structure of the CmABCB1 G132V mutant, which favors the outward‐facing state, reveals the mechanism of the pivotal joint between TM1 and TM32021

    • Author(s)
      Matsuoka Keita、Nakatsu Toru、Kato Hiroaki
    • Journal Title

      Protein Science

      Volume: 30 Issue: 5 Pages: 1064-1071

    • DOI

      10.1002/pro.4058

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structure of CmABCB1 multi-drug exporter in lipidic mesophase revealed by LCP-SFX2021

    • Author(s)
      Pan Dongqing、Oyama Ryo、Sato Tomomi、Nakane Takanori、Mizunuma Ryo、Matsuoka Keita、Joti Yasumasa、Tono Kensuke、Nango Eriko、Iwata So、Nakatsu Toru、Kato Hiroaki
    • Journal Title

      IUCrJ

      Volume: 9 Issue: 1 Pages: 134-145

    • DOI

      10.1107/s2052252521011611

    • NAID

      120007179308

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      2021 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] ABCB1/MDR1/P‐gp employs an ATP‐dependent twist‐and‐squeeze mechanism to export hydrophobic drugs2020

    • Author(s)
      Kodan Atsushi、Futamata Ryota、Kimura Yasuhisa、Kioka Noriyuki、Nakatsu Toru、Kato Hiroaki、Ueda Kazumitsu
    • Journal Title

      FEBS Letters

      Volume: 595 Issue: 6 Pages: 707-716

    • DOI

      10.1002/1873-3468.14018

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 次世代抗体医薬品開発へのアプローチ2024

    • Author(s)
      ◯溝端栄一
    • Organizer
      SAKIGAKEシンポジウム2024「量子生体科学のフロンティア:先駆的アプローチと未来の展望」
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      2023 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] トマトの苦味物質トマチンを酸化的に代謝する酵素群の基質認識メカニズムの解明と改変2023

    • Author(s)
      〇吉岡剛汰, 宮崎麻紗美, 秋山遼太, 水谷正治, 野川俊彦, 越野広雪, 佐藤裕介, 日野智也, 永野真吾
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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  • [Presentation] 高活性ブラシノステロイドの生合成に関与する酵素CYP85A3のX線結晶構造解析2023

    • Author(s)
      〇児島よしの、眞鍋菜緒子、藤山敬介、大西利幸、水谷正治、佐藤裕介、日野智也、永野真吾
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 複雑な梯子状疎水基を生産するアナモックス菌のアシルキャリアプロテインとSAM依存性メチル基転移酵素の相互作用に関する構造生物学に基づいた考察2023

    • Author(s)
      〇上垣哲心、竹井大誉、山口修平、藤山啓介、佐藤祐介、日野智也、永野真吾
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Structural Biology of 2-Oxoglutarete-dependent Dioxygenases Involved in α-Tomatine Metabolism in Solanaceae2023

    • Author(s)
      ◯Shingo Nagano
    • Organizer
      15th International Symposium on Cytochrome P450 Biodiversity and Biotechnolgoy
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Functional modification of 2-oxoglutarate dependent dioxygenases that oxidatively metabolize tomatine2023

    • Author(s)
      〇吉岡剛汰,宮崎麻紗美, 秋山遼太, 水谷正治, 野川俊彦, 越野広雪, 佐藤裕介, 日野智也, 永野真吾
    • Organizer
      2023 International Joint Meeting of the 23rd International Conference on Cytochrome P450 and the 38th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] X-ray structural analysis of CYP85A3 involved in biosynthesis of highly active brassinosteroids2023

    • Author(s)
      〇児島よしの、眞鍋菜緒子、藤山敬介、大西利幸、水谷正治、佐藤裕介、日野智也、永野真吾
    • Organizer
      2023 International Joint Meeting of the 23rd International Conference on Cytochrome P450 and the 38th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics
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  • [Presentation] 複雑な梯子状疎水基を生産するアナモックス菌のアシルキャリアプロテインとSAM依存性メチル基転移酵素の相互作用に関する構造生物学に基づいた考察2023

    • Author(s)
      〇上垣哲心、竹井大誉、山口修平、藤山啓介、佐藤祐介、日野智也、永野真吾
    • Organizer
      第96回日本生化学会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] X線結晶構造解析による発光タンパク質イクオリンのカルシウム結合に伴う動的立体構造変化の解明2023

    • Author(s)
      〇森口舞子, 船橋俊也, 中津亨
    • Organizer
      第38回生物発光化学発光研究会学術講演会
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  • [Presentation] イクオリンCa2+間相互作用の熱力学・速度論的解析2023

    • Author(s)
      〇黒木麗, 大崎優香, 船橋俊也, 中津亨, 木村哲就
    • Organizer
      第96回日本生化学会大会
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  • [Presentation] イクオリンのCa2+結合によって誘起される化学発光反応に関する熱力学・速度論的解析2023

    • Author(s)
      〇黒木麗, 大崎優香, 船橋俊也, 中津亨, 木村哲就
    • Organizer
      第23回日本蛋白質科学会年会
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 光スイッチング蛍光タンパク質rsGamillusの時分割構造解析2023

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      ◯溝端栄一
    • Organizer
      令和5年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
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      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] X-ray crystallography of sesamin biosynthetic CYP81Q proteins2023

    • Author(s)
      ◯Eiichi Mizohata, Ryo Yonezawa, Kenshin Kondoh, Erisa Harada, Hiromi Toyonaga, Manabu Horikawa, Eiichiro Ono
    • Organizer
      2023 International Joint Meeting of the 23rd International Conference on Cytochrome P450 and the 38th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics
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      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 高活性ブラシノステロイド生合成に関わるCYP85A3の結晶化スクリーニング2022

    • Author(s)
      〇眞鍋 菜緒子、藤山 敬介、水谷 正治、佐藤 裕介、日野 智也、永野 真吾
    • Organizer
      第48回生体分子科学討論会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 立体選択的な Diels-Alder 反応を行う酵素の生成物結合型の結晶構造とその反応過程の分子動画撮影に向けた変異体作製と結晶化2022

    • Author(s)
      〇長谷川颯人、日野智也、佐藤裕介、永野真吾
    • Organizer
      第48回生体分子科学討論会
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      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] Structural Basis of Metabolic Detoxification of α-Tomatine by Various 2-Oxoglutarete-Dependent Dioxygenases2022

    • Author(s)
      ○Shingo Nagano, Asami Miyazaki, Keisuke Fujiyama, Saki Yasuda, Yusuke Sato, Tomoya Hino, Ryota Akiyma, Bunta Watanabe, Masaharu Mizutani, Mitsuo Shoji, Yasuteru Shigeta,
    • Organizer
      The 12th International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines
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      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Structural and mechanistic analysis of various 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases involved in α-tomatine metabolism in Solanaceae2022

    • Author(s)
      Asami Miyazaki, Keisuke Fujiyama, Yusuke Sato, Tomoya Hino, Ryota Akiyma, Jumpei Kato, Masaharu Mizutani, Bunta Watanabe, Mitsuo Shoji, Yasuteru Shigeta, ○Shingo Nagano
    • Organizer
      The 22nd International Conference on Cytochrome P450
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Structural Biology of 2-Oxoglutarate-dependent Dioxygenases Involved in α-Tomatine Metabolism in Solanaceae2022

    • Author(s)
      Shingo Nagano
    • Organizer
      10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Reaction mechanism of methylenedioxy bridge formation by a cytochrome P4502022

    • Author(s)
      Kenshin Kondoh, Ryo Yonezawa, Eiichi Mizohata
    • Organizer
      AsCA2022
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] XFELを用いた光スイッチング蛍光タンパク質の時分割構造解析2022

    • Author(s)
      溝端栄一
    • Organizer
      テクノアリーナ フォトニクス・センシング工学グループ 第2回交流フォーラム
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    • Invited
  • [Presentation] CO2固定酵素 Rubiscoの動的構造解明への挑戦2022

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      溝端栄一
    • Organizer
      第22回日本蛋白質科学会年会
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  • [Presentation] カルシウムはどのようにして発光タンパク質イクオリンを発光に導くのか?2022

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      〇中津亨
    • Organizer
      第48回生体分子科学討論会
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  • [Presentation] ITCを用いたイクオリンCa2+間相互作用の熱力学的解析2022

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      〇黒木麗, 船橋俊也, 大西裕介, 中津亨, 木村哲就
    • Organizer
      第48回生体分子科学討論会
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  • [Presentation] 麻疹ウイルス膜融合阻害ペプチドの構造最適化研究2022

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      〇山口夕貴,高原葵,青木啓輔,中津亨,平田和成,鈴木聡志,林宏典,河治久実,井貫晋輔,大野浩章,加藤博章,村山和隆,児玉栄一,大石真也
    • Organizer
      第39回メディシナルケミストリーシンポジウム
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      ○中津 亨
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  • [Presentation] CO2固定酵素RuBisCOの分子動画撮影条件の検討2021

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      ◯清田雄大、熊野翔太、溝端栄一
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      ○Eiichi Mizohata
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      Pacifichem 2021
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      〇永野真吾
    • Organizer
      第47回生体分子科学討論会
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  • [Presentation] スクアレン合成酵素に類似した放線菌由来新規カルバゾールプレニル基転移酵素の結晶構造と反応機構2021

    • Author(s)
      〇末宗周憲, 永田 隆平, 小林 正弥, 品田 哲郎, 西山 真, 葛山 智久, 佐藤裕介, 日野 智也, 永野 真吾
    • Organizer
      第21回日本蛋白質科学会年会
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  • [Presentation] ジャガイモやトマトに含まれる有毒なスピロソランを 代謝変換する16位水酸化酵素と20位脱水素酵素の反応メカニズム2021

    • Author(s)
      〇宮崎麻紗美, 藤山敬介, 佐藤祐介, 日野智也, 水谷正治, 秋山遼太, 加藤純平, 重田育照, 庄司光男, 永野真吾
    • Organizer
      第21回日本蛋白質科学会年会
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      〇末宗周憲, 永田 隆平, 小林 正弥, 品田 哲郎, 西山 真, 葛山 智久, 佐藤裕介, 日野 智也, 永野 真吾
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      第15回バイオ関連化学シンポジウム
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  • [Presentation] トマチンを代謝する2種類の酸化酵素の結晶構造が示す意外な分子メカニズム2021

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      〇宮崎麻紗美, 藤山敬介, 佐藤祐介, 日野智也, 水谷正治, 秋山遼太, 加藤純平, 重田育照, 庄司光男, 永野真吾,
    • Organizer
      令和3年 (2021年) 度 日本結晶学会年会
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  • [Presentation] タウリン水酸化酵素の時分割シリアルフェムト秒X線結晶構造解析に向けた微結晶化と構造解析2021

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      〇三坂圭生,宮﨑麻紗美,日野智也,佐藤裕介,永野真吾
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      令和3年 (2021年) 度 日本結晶学会年会
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  • [Presentation] Two tales of Diels-Alderases: How decalin skeletons are stereo-selectively constructed2021

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      〇Shingo Nagano
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      RIKEN CSRS Seminar
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  • [Presentation] 立体選択性が異なるディールスアルダー反応をおこなう 酵素Phm7とFsa2の分子機構2021

    • Author(s)
      〇永野真吾
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      第54回酸化反応討論会
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  • [Presentation] 〇永野真吾2021

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      立体選択性が異なる 2 種類の Diels-Alder 反応酵素がデカリン骨格を構築する分子メカニズム
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      〇永野真吾
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      日本薬物動態学会第36回年会
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  • [Presentation] 植物ステロイド化合物の生合成と代謝の構造生物学2021

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      〇永野真吾
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      ○中津 亨
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  • [Presentation] カルシウム結合型発光タンパク質イクオリンには過酸化状態が存在する2021

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      ○船橋 俊也、南後 恵理子、岩田 想、加藤 博章、中津 亨
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      日本薬学会 第141年会
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      ○筒井 隼一、陳 月、中津 亨、加藤 博章、潘 東青
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      ○水沼 諒、小田島 圭、三和 空知、潘 東青、瀧川 紘、中津 亨、高須 清誠、加藤 博章
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      日本薬学会 第141年会
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      ○中津 亨
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      ○中津 亨
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      〇宮﨑麻紗美、藤山敬介、日野智也、水谷正治、永野真吾
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      第93回日本生化学会大会
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      ◯宮﨑麻紗美、藤山敬介、日野智也、水谷正治、秋山遼太、加藤純平、永野真吾
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      溝端栄一
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Published: 2019-07-04   Modified: 2025-01-30  

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