酵素が巧みに織りなす化学反応過程のダイナミズムの撮像
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
19H05780
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
永野 真吾 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中津 亨 和歌山県立医科大学, 薬学部, 教授 (50293949)
溝端 栄一 大阪大学, 工学研究科, 講師 (90571183)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥134,290,000 (Direct Cost: ¥103,300,000、Indirect Cost: ¥30,990,000)
Fiscal Year 2022: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000)
Fiscal Year 2021: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
Fiscal Year 2020: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
Fiscal Year 2019: ¥35,490,000 (Direct Cost: ¥27,300,000、Indirect Cost: ¥8,190,000)
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| Keywords | X線自由電子レーザー / 分子動画 / 酵素 / 結晶構造解析 / 反応メカニズム / 結晶構造 / 酵素反応 / メカニズム / XFEL / 微結晶 / 時分割X線結晶構造解析 / ディールスアルダー反応 / Rubisco / 発光タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
酵素が機能する仕組みを明らかにするためには、その反応が起こりつつある非平衡状態の反応場の構造を高い空間・時間分解能で解析することが必須である。本研究では、研究代表者と分担者らがすでに結晶構造を決定した分子内ディールスアルダー環化反応を行う酵素，光合成炭酸固定の鍵酵素Rubisco，および発光タンパク質イクオリンを対象に、南後班で開発する温度ジャンプ法や二液混合法など光トリガーに依存しない手法、および清中班と共同で開発する光作動性を付与したケージド基質を用いる手法を駆使して酵素反応を同期的に進行させ、酵素が基質を巧みに操り化学反応を進める過程を、高い時間・空間分解能で解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
永野酵素班では，代表者の永野がディールスアルダー反応を行う酵素，分担者の溝端が炭素固定鍵酵素Rubisco，中津が発光タンパク質イクオリンの高速分子動画の撮影を目指して研究を進めている。本年度は，試料調製を中心に研究を進め，それぞれの研究実績の概要は以下の通り。
ディールスアルダー反応を行う酵素Phm7の結晶構造を決定し，ドッキングシミュレーションなどの理論計算により基質が結合する部位を推定した。また，試験管内でディールスアルダー反応の活性測定系を確立し，推定される基質結合部位のアミノ酸の置換によって活性が大きく減少することなどを確認した。このことからドッキングシミュレーションで推定された部位に基質が結合すると考えられ，この酵素によるディールスアルダー反応のメカニズムの一端を明らかにしつつあり，今後の高速分子動画の撮影の重要なデータを得ることができた。
Rubiscoについては，微結晶の調製方法を確立することができた。次に，精製試料を用いた微結晶の作製条件，および，得られた微結晶がSFX計測の際に安定に保持されるバッファーの条件を確立した。SACLAにてノーマルSFXにより回折データを収集し，分解能1.9オングストロームで結晶構造を決定することに成功し，今後の高速分子動画の撮影に期待が持たれる。
また，発光タンパク質であるイクオリンの大量発現系の構築および，SACLA実験に向けた新規結晶化条件の探索を行い，数十ミリグラムのイクオリンを生産できる発現系を確立し，1.4オングストローム分解能で構造決定することができた。これらの結果は高速分子動画の撮影の準備が整いつつあることを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではディールスアルダー反応を行う酵素Phm7，炭素固定化酵素Rubisco,そして発光タンパク質イクオリンをターゲットとしているが，すべての酵素について結晶構造が決定されており，Rubiscoについては微結晶を用いたSFXによる結晶構造解析も完了するなど，高速分子動画撮影の準備が進みつつある。また，Phm7では，基質の安定性が低いため非常に困難と思われていた試験管内活性測定系を確立し，ディールスアルダー反応の制御機構を明らかにするために重要な評価を行うことが可能となった。イクオリンについて，従来は塩である硫酸アンモニウムを沈殿剤として結晶化を行っていたが，SFX実験の際，塩が析出し測定に支障が生じる課題があった。そこで，塩とは異なり高分子のPEG400を用いた新たな条件で結晶が得られ，SPring-8のBL41XUでX線回折実験を行い，1.4オングストローム分解能での立体構造決定に成功した。さらに水素の位置を観測するための大型結晶，SACLA実験に向けた微結晶もできており，今年度の実験を行うための準備も順調にできている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ディールスアルダー反応を行う酵素については微結晶の調製をすすめ，BL41XUビームラインを利用したSS-ROXによる結晶の質の評価を行う。また，温度ジャンプ法による酵素反応の同期的な開始をめざし準備を進める。
また，Rubisocoについては時分割SFXにより分子動画を撮影するための条件検討を進める。微結晶中での酵素反応速度を明らかにし，反応開始後，どのタイミングでXFELを照射して構造のスナップショットを撮影するかを見積もる。また，反応の同期的制御に必要なケージド基質濃度やレーザー照射の効率を最適化する。
イクオリンについては，発光メカニズムの全容解明に必要な水素の位置の決定を目指し1.0オングストローム分解能を超える構造解析を実施する。また微結晶を用いてBL41XUにおけるSS-ROX実験を行うことにより，SACLA実験に適した質，サイズの結晶が得られる条件を探索する。また，最適化された条件で得られる結晶から収集した回折データからX線のダメージを受けやすいイクオリンの過酸化状態の構造を確認する。その後，SFX実験を実施する。イクオリンはカルシウムイオンの結合に伴う構造変化により発光がスタートすると考えられている。そこで，溶液中におけるカルシウムイオンの結合について速度論的解析を行う。
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Report
(1 results)
Research Products
(20 results)
