時間分解構造解析を補完する精密顕微分光計測

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 19H05784
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 久保 稔 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (90392878)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 講師 (70506906) ; 古谷 祐詞 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80432285)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥142,870,000 (Direct Cost: ¥109,900,000、Indirect Cost: ¥32,970,000); Fiscal Year 2021: ¥24,310,000 (Direct Cost: ¥18,700,000、Indirect Cost: ¥5,610,000); Fiscal Year 2020: ¥22,880,000 (Direct Cost: ¥17,600,000、Indirect Cost: ¥5,280,000); Fiscal Year 2019: ¥49,400,000 (Direct Cost: ¥38,000,000、Indirect Cost: ¥11,400,000)
• Keywords: 分子分光学 / 時間分解計測 / 超精密計測 / 蛋白質 / 生物物理学 / 時間分解X線結晶構造解析 / 時間分解紫外可視吸収分光 / 時間分解赤外分光 / 時間分解ラマン分光 / 時間分解蛍光分光 / 動的構造生物学

Outline of Research at the Start

私たちの体の中では多くの分子が働いており、エネルギー変換、物質輸送、物質代謝などの生命活動を担っています。それらの生体分子は、形を巧みに変えながら働く、謂わば、小さな分子機械です。最近、生体分子が働く様子を動画として観測できる「時間分解Ｘ線構造解析」という手法が開発されました。私たちは、紫外光、可視光、赤外光などさまざまな光を道具に、時間分解Ｘ線構造解析では原理的に観測が難しい、電子レベルの細かな解析を精密に行ないます。時間分解Ｘ線構造解析と相補的に研究を進めながら、生体分子が働くしくみを物理化学的に解明します。

Outline of Annual Research Achievements

本新学術領域の目標の一つは、時間分解結晶構造解析を軸としたタンパク質のダイナミクス研究を他分野と複合的に融合させて、タンパク質を設計・制御・操作する新しい学問領域を形成することである。そこで本研究では、時間分解結晶構造解析と時間分解分光法（紫外可視吸収、ラマン、赤外、蛍光）との相関的・補完的解析を推進し、時間分解結晶構造解析と他手法との融合の先鞭をつける。本年度は、各分光法について、タンパク質微結晶に適用できる時間分解測定技術の開発に取り組んだ。
・紫外可視吸収分光：240-700 nmの広波長範囲を測定できる時間分解顕微分光装置を開発し、新規ロドプシン微結晶の光反応観測に応用した。現在、その分光結果を参照して、時間分解結晶構造解析を進めている。今後は、DNAフォトリアーゼなど他の系へと適用範囲を拡げる。
・赤外分光：新規ロドプシン類（溶液系）の時間分解測定に成功し、光反応サイクルの速度や構造変化を観測した。また、微結晶への適用に向けて、顕微測定用の赤外分光セルを開発した。今後は、時間分解結晶構造解析との相補解析に向けて、微結晶の時間分解測定にも取り組む。
・ラマン分光：ポンプレーザーを導入し、顕微ラマン光学系を構築した。今後は、ヘム酵素をモデル試料に用いて、時間分解顕微測定系の開発を進める。
・蛍光分光：微結晶とリガンドを急速混合する二液混合ミキサーを開発し、Ca2+感受性発光タンパク質イクオリンの時間分解蛍光測定に成功した。今後は分光器を導入し、波長選択的な解析を進めるとともに、時間分解結晶構造解析の実験条件を決定する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

すべての分光法について計画通りに顕微測定系の開発が進んでいる。紫外可視吸収分光においては、すでに新規ロドプシンの系に適用し、時間分解X線結晶構造解析に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

紫外可視吸収分光においては、DNAフォトリアーゼを主たる研究対象とし、DNA光修復反応の中間体を時間分解測定で捉える。赤外分光においては、新規ロドプシン類やヘム酵素をモデルに、微結晶の時間分解測定に取り組む。またラマン分光においても、時間分解顕微測定系の開発を進める。蛍光分光においては、分光器を導入して二液混合系の顕微蛍光分光装置を完成させ、イクオリン微結晶に適用する。

Research Products

• [Journal Article] Comparing serial X-ray crystallography and microcrystal electron diffraction (MicroED) as methods for routine structure determination from small macromolecular crystals (2020)
  • Author(s): Wolff, A. M., Kubo, M. et al.
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 7 Pages: 306-323
  • DOI: 10.1107/s205225252000072x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Syntheses, characterizations, and crystal Structures of dinitrogen-divanadium complexes bearing triamidoamine ligands. (2020)
  • Author(s): Kokubo, Y., Wasada-Tsutsui, Y., Yomura, S., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kugimiya, S., Kajita, Y., Ozawa, T., Masuda, H.
  • Journal Title: European Journal of Inorganic Chemistry Volume: 2020 Pages: 1456-1464
  • DOI: 10.1002/ejic.201901123
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Direct measurements of ferric reductase activity of human 101F6 and its enhancement upon reconstitution into phospholipid bilayer nanodisc (2020)
  • Author(s): El-Behery, M., Fujimura, M., Kimura, T., Tsubaki, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Rep. Volume: 21 Pages: 100730-100730
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2020.100730
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Infrared spectroscopic analysis on structural changes around the protonated Schiff base upon retinal isomerization in light-driven sodium pump KR2. (2020)
  • Author(s): S. Tomida, S. Ito, T. Mato, Y. Furutani, K. Inoue, H. Kandori
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics Volume: - Pages: 148190-148190
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2020.148190
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Oxidative DNA cleavage, formation of μ-1,1-hydroperoxo species, and cytotoxicity of dicopper(II) complex supported by a p-cresol-derived amide-tether ligand (2019)
  • Author(s): Kadoya, Y., Fukui, K., Hata, M., Miyano, R., Hitomi, Y., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kodera, M.
  • Journal Title: Inorg. Chem. Volume: 58 Pages: 14294-14298
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.9b02093
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fundamental electron-transfer and proton-coupled electron-transfer properties of Ru(iv)-oxo complexes (2019)
  • Author(s): Hiroaki Kotani, Hinatsu Shimomura, Momoka Horimoto, Tomoya Ishizuka, Yoshihito Shiota, Kazunari Yoshizawa, Sachiko Yanagisawa, Yuka Kawahara-Nakagawa, Minoru Kubo, Takahiko Kojima
  • Journal Title: Dalton Trans. Volume: 48 Pages: 13154-13161
  • DOI: 10.1039/c9dt02734c
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pump-Probe Time-Resolved Serial Femtosecond Crystallography at SACLA: Current Status and Data Collection Strategies (2019)
  • Author(s): Nango Eriko、Kubo Minoru、Tono Kensuke、Iwata So
  • Journal Title: Appl. Sci. Volume: 9 Pages: 5505-5505
  • DOI: 10.3390/app9245505
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] XFEL結晶構造解析と振動分光法を用いたタンパク質の動的精密構造解析 (2019)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: 鳥取大学GSCセミナー，鳥取大学工学部附属GSC研究センター（鳥取県・鳥取市），2019年9月27日．
  • Invited
• [Presentation] タンパク質の動的構造と機能 (2019)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: 第46回生体分子科学討論会，筑波大学大学会館（茨城県つくば市），2019年6月22日．
  • Invited
• [Presentation] Membrane Protein Dynamics Studied by Time-resolved Measurements (2019)
  • Author(s): Kimura, T.
  • Organizer: Indo-Japan Joint Workshop “Frontiers in Molecular Spectroscopy: From Fundamentals to Applications in Chemistry and Biology” Nov. 1, 2019, Kobe (Japan).
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 赤外分光法によるイオンチャネルタンパク質におけるイオン-タンパク質間相互作用の研究 (2019)
  • Author(s): 古谷祐詞
  • Organizer: ISSPワークショップ「レチナールタンパク質の光機能発現の物理と化学」プログラム, 東京大学物性研究所（千葉県・柏市）, 2019年9月5日．
• [Presentation] Time-resolved FTIR spectroscopy for studying molecular mechanisms of sodium and lithium ion transportation of Krokinobacter rhodopsin 2 (2019)
  • Author(s): Tomida, S., Kandori, H., Furutani, Y.
  • Organizer: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Sep. 24-26, 2019, Seagaia Convention Center (Miyazaki, Miyazaki).
• [Presentation] Characterization of Antarctic inward proton pumping microbial rhodopsins (AntRs) (2019)
  • Author(s): Harris, A., Tomida, S., Schubert, L., Lazaratos, M., Watt, E., Hoang, A., Bondar, A.-N., Heberle, J., Furutani, Y., Kandori, H., Brown, L.
  • Organizer: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Sep. 24-26, 2019, Seagaia Convention Center (Miyazaki, Miyazaki).
• [Presentation] Structural features of enzyme rhodopsins revealed by infrared spectroscopy (2019)
  • Author(s): Watari, M., Ikuta, T., Hutamata, H., Yamada, D., Shihoya, W., Yoshida, K., Furutani, Y., Tsunoda, S., Nureki, O., Kandori, H.
  • Organizer: The 57th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, Sep. 24-26, 2019, Seagaia Convention Center (Miyazaki, Miyazaki).
• [Remarks] 名古屋工業大学 古谷研究室ホームページ
  • URL: http://biophys-molsci.web.nitech.ac.jp/index.html