Comprehensive research of signal transduction of cell
| Project Area | Information physics of living matters |
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| Project/Area Number |
19H05797
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
石島 秋彦 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (80301216)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福岡 創 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (50447190)
蔡 栄淑 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (40378716)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥108,810,000 (Direct Cost: ¥83,700,000、Indirect Cost: ¥25,110,000)
Fiscal Year 2021: ¥21,060,000 (Direct Cost: ¥16,200,000、Indirect Cost: ¥4,860,000)
Fiscal Year 2020: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000)
Fiscal Year 2019: ¥25,740,000 (Direct Cost: ¥19,800,000、Indirect Cost: ¥5,940,000)
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| Keywords | 走化性 |
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| Outline of Research at the Start |
大腸菌走化性システムは、外界の誘因・忌避物質が細胞極に存在する受容体に結合し、その情報は細胞内を通して各モーターに伝わり、モーターの回転方向が転換される。申請者は、走化性刺激受容において、協同性、適応性、自発性の3つの特徴が、受容体のメチル化レベルの変動という共通の分子機構で実現されている、という従来説とは全く異なる新しいモデルを提唱している。そこで、１細胞レベルでの走化性動態を、活性を保ったまま明らかにする。分子レベルの反応ネットワークと細胞レベルの応答をつなぐ格好のモデル系であり、領域内の理論グループとの共同研究体制を構築することにより実験と理論との有機的な融合を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，バクテリア走化性に関わるすべてのタンパク質の挙動を1 細胞レベルでイメージングすることにある．さらに、本来の機能を有した状態での蛍光タンパク質との融合タンパク質の作成のため、可能性のある結合部位、リンカーの種類・長さ、蛍光タンパク質を網羅的に調べ上げる．
特に， CheYとCheZという走化性に関わるタンパク質双方に蛍光色素を導入しFRET計測を行った．その結果，セリンなどの誘因物質投与後にFRET効率が下がり，グリセロールなどの忌避物質投与後にFRET効率が上がった．同時に計測していたべん毛モーターの回転計測においては，セリン投与後にCCW，グリセロール投与後にCWを示した．さらに，セリン投与後，数十秒後にFRET効率が復活した．これは適応現象を観察したことになる．この適応現象を説明するために，不完全ガンマ関数を用いた反応スキームを検討し，フィッティングを行った．
さらに適応現象に必要なタンパク質，CheBに蛍光標識を行い，細胞極への局在状況を計測した．イソロイシンなどの忌避物質投与後に極の蛍光強度は一過的な上昇を示し，その後減少した．この現象もまた不完全ガンマ関数で検討を行った．
不完全ガンマ関数は，逐次反応ステップを検討するには有効な手法である．我々の解析結果からステップ数は最大400となることがわかった．この値はレセプターのメチル化の段階，4ステップに比べて桁違いに大きく，単なるメチル化の状態だけでは説明がつかない．レセプターは極に1万の単位で存在していることがわかっており，我々の解析結果はレセプター単体だけではなく，複数のレセプターのメチル化状態を考慮することで説明できるのかもしれない
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CheYとCheZという走化性に関わるタンパク質双方に蛍光色素を導入しFRET計測を行った．その結果，セリンなどの誘因物質投与後にFRET効率が下がり，グリセロールなどの忌避物質投与後にFRET効率が上がった．同時に計測していたべん毛モーターの回転計測においては，セリン投与後にCCW，グリセロール投与後にCWを示した．さらに，セリン投与後，数十秒後にFRET効率が復活した．これは適応現象を観察したことになる．この適応現象を説明するために，不完全ガンマ関数を用いた反応スキームを検討し，フィッティングを行った．
さらに適応現象に必要なタンパク質，CheBに蛍光標識を行い，細胞極への局在状況を計測した．イソロイシンなどの忌避物質投与後に極の蛍光強度は一過的な上昇を示し，その後減少した．この現象もまた不完全ガンマ関数で検討を行った．不完全ガンマ関数は，逐次反応ステップを検討するには有効な手法である．我々の解析結果からステップ数は最大400となることがわかった．この値はレセプターのメチル化の段階，4ステップに比べて桁違いに大きく，単なるメチル化の状態だけでは説明がつかない．レセプターは極に1万の単位で存在していることがわかっており，我々の解析結果はレセプター単体だけではなく，複数のレセプターのメチル化状態を考慮することで説明できるのかもしれない
また，細胞集団としての振る舞いと情報伝達関連タンパク質との関係を調べるため，電機イオン浸透システムを用いて集団の振る舞いを調べた．ガラスピペットに誘引物質であるセリンを入れ，そこからセリンを放出する．大腸菌はピペット中心に走化性応答により集まる．セリン放出，停止のタイミングと大腸菌の分布などを調べた．
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| Strategy for Future Research Activity |
B02-1: バクテリア走化性に関わるすべてのタンパク質を1細胞レベルでイメージングする バクテリア走化性に関わるすべてのタンパク質の挙動を1細胞レベルでイメージングを行う。FRET（蛍光エネルギー移動）光学系においてさらなるS/Nの向上を目指すために，新規蛍光タンパク質の導入，新しいカメラによる感度の上昇などを向上させ，タンパク質同士の位置の変化をリアルタイムで追跡する。
B02-2: 回転方向転換とCheY-P結合数の関係を明らかにする．申請者らは、バクテリアべん毛モーターの回転方向転換に必要なCheY-Pの数を13個と見積った(Sci Signal, 2014)。この値は予想される結合部位(32個)に対して少ない値であり、協同的な作用の存在を示唆している。この13個の協同性を明らかにすることを目標とし、新規蛍光タンパク質を用いた感度の上昇，分解能の上昇を目指す．
B02-3: 4状態イジングモデルを用いて受容体におけるメチル化の動態を明らかにする．受容体の活性化は下流への情報伝達以外にも適応に関わるリン酸化も促進する。そこで、メチル化・脱メチルを考慮した4状態イジングモデルを構築し自発的な活性・不活性化を再現する。さらに，下流の反応を加え，適応現象におけるラグライムの再現，不完全ガンマ関数を用いた実験結果の再現，モンテカルロ法，差分法，ルンゲクッタ法などを用いて実験結果を効率よく再現する手法の開発を行う
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Report
(1 results)
Research Products
(8 results)
