Optical control of the plasma membrane functions by using dynamic exciton

• Project Area: Dynamic Exciton: Emerging Science and Innovation
• Project/Area Number: 20H05842
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (II)
• Research Institution: Toyama Prefectural University
• Principal Investigator: 村上 達也 富山県立大学, 工学部, 教授 (90410737)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 沼田 朋大 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (20455223)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥77,350,000 (Direct Cost: ¥59,500,000、Indirect Cost: ¥17,850,000); Fiscal Year 2024: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2023: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2022: ¥10,140,000 (Direct Cost: ¥7,800,000、Indirect Cost: ¥2,340,000); Fiscal Year 2021: ¥18,330,000 (Direct Cost: ¥14,100,000、Indirect Cost: ¥4,230,000); Fiscal Year 2020: ¥28,340,000 (Direct Cost: ¥21,800,000、Indirect Cost: ¥6,540,000)
• Keywords: 視力回復 / 光細胞工学 / 電荷分離分子 / ドラッグデリバリーシステム / 脂質ナノ粒子 / 膜電位 / ナノ電場 / 光制御 / 点眼 / 細胞膜電位 / 膜融合 / 配向制御 / ドラッグデリバリー / イオンチャネル / 神経発火 / 薬物送達 / 難病治療

Outline of Research at the Start

本研究の最終目標は、ドナー分子(D)とアクセプター分子(A)で構成されるD-A連結分子を用いて、神経難病の光治療や生体深部イメージングを実現することである。光照射下でD-A連結分子により発生する分子内電荷分離状態（Dが正電荷、Aが負電荷を帯びる）を強力なナノ電場と捉える。このナノ電場を神経伝達のために細胞膜電位というナノ電場を利用している神経細胞に作用させ、その伝達をD-A連結分子でコントロールすることを目指す。さらに高効率で赤外発光するよう巧妙に設計されたD-A連結分子を別途開発し、生体深部がんのイメージング剤としての可能性も探求する。

Outline of Annual Research Achievements

ドナー－アクセプター連結分子（Ｄ―Ａ分子）による視神経細胞活動の光操作、究極には、点眼による失明患者の視力回復に向けて、Ｄ－Ａ分子の（１）細胞膜内輸送と（２）細胞膜内異方的配置（Ｄ部分は細胞内側，Ａ部分は細胞外側）に注力した。
まず（１）を実現するためのＤ－Ａ分子輸送キャリアの開発について報告する。これまでのキャリア（ＮＤ）と膜融合性脂質を用いて作製した膜融合性ＮＤ（ｆＮＤ）を蛍光ラベルし、培養神経細胞に作用させると、ｆＮＤの細胞親和性はＮＤのそれに比べてかなり低下することがわかった。そこで次にｆＮＤの細胞膜親和性を向上させるため、ｆＮＤに含まれる細胞膜透過ペプチドを、現状のＴＡＴ（ＨＩＶ由来）からＰＥＮ（ショウジョウバエ由来）に変更したところ、顕著な改善が観察された。一方で、ＰＥＮを含むＮＤはｆＮＤの約７０％の膜融合活性を示した。つまりＰＥＮは膜接着・膜融合活性いずれにも優れることが明らかとなった。
次に（２）についてモデル実験を行った。Ｄ－Ａ分子のモデルとして用いてきたカチオン化フラーレン（ＣａｔＣ６０）を含むリン脂質膜を作製し、その後水和させてリポソームを作製したところ、ＣａｔＣ６０添加量に応じて、得られるリポソームの脂質膜相転移が減弱し、本方法によってＣａｔＣ６０を膜中に含むリポソームを作製できることがわかった。ＣａｔＣ６０搭載リポソームに、Ｄ－Ａ分子を細胞膜内で異方的に配向させるためのアンカー分子（ｐｙｒｅｎｅｂｕｔｙｒａｔｅ，　ＰｙＢ）を添加すると、ＰｙＢ蛍光はＣａｔＣ６０搭載量の増加とともに減弱した。以上のことから、ＰｙＢはコンセプト通り、Ｄ－Ａ分子の細胞膜内異方的配置の実現に寄与する可能性が明らかとなった。
ＰｙＢを作用させた培養神経細胞に、Ｄ－Ａ分子（ＴＣ１）を搭載させた上記ＮＤを作用させ、光照射すると、照射直後のみ素速い膜電位変化が観察された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ＰＥＮという新しいペプチドを利用することで、細胞膜親和性と細胞膜融合活性を併せ持ったＮＤを作製することに成功した。脂質組成がこれまでのＮＤと同じであることから、Ｄ－Ａ分子搭載も問題なく行えることが期待される。
Ｄ－Ａ分子の細胞膜内異方的配置のためのアンカー分子（ＰｙＢ）の利用というコンセプトが、ＣａｔＣ６０というＤ－Ａモデル分子で実証できたことは大きな前進だと考えている。今後Ｄ－Ａ分子を用いて、同様の実験を行いたい。
そして最大の研究成果は、膜融合活性を有するＮＤとＰｙＢの利用によって、培養神経細胞における光誘導膜電位変化が迅速化されたことである。つまり本研究課題の中心コンセプトが部分的に証明されたと考えている。

Strategy for Future Research Activity

追加合成されたＤ－Ａ分子（ＴＣ１）を入手できたため、まずは上記の迅速な光誘導膜電位変化の再現性を調べる。上記の研究実績の概要には記載しなかったが、使用するＮＤの種類に応じて、迅速な光誘導膜電位変化の出現タイミングが異なるという奇妙な現象を観察しているため、このメカニズムを探究する。
蛍光ラベルＮＤをマウスに点眼し、角膜吸収・網膜移行性を評価する。
ＴＣ１とは異なるメカニズムで分子内に正負電荷を生じる分子を作田博士（長崎大院工）から入手する予定であり、入手し次第、ＮＤ搭載を試み、光誘導膜電位変化するかどうか調べる。

Research Products

• [Journal Article] Intermediate conductance Ca2+-activated potassium channels are activated by functional coupling with stretch-activated nonselective cation channels in cricket myocytes (2023)
  • Author(s): Numata Tomohiro、Sato-Numata Kaori、Yoshino Masami
  • Journal Title: Frontiers in Insect Science Volume: 2 Pages: 1100671-1100671
  • DOI: 10.3389/finsc.2022.1100671
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sigma-1 receptor is involved in modification of ER-mitochondria proximity and Ca2+ homeostasis in cardiomyocytes (2023)
  • Author(s): Tagashira Hideaki、Bhuiyan Md. Shenuarin、Shinoda Yasuharu、Kawahata Ichiro、Numata Tomohiro、Fukunaga Kohji
  • Journal Title: Journal of Pharmacological Sciences Volume: 151 Issue: 2 Pages: 128-133
  • DOI: 10.1016/j.jphs.2022.12.005
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 加齢黄斑変性治療標的としての高密度リポタンパク質 (2022)
  • Author(s): 村上 達也
  • Journal Title: 別冊BIO Clinica Volume: 11 Pages: 92-96
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Potential of Lipoprotein-Based Nanoparticulate Formulations for the Treatment of Eye Diseases (2020)
  • Author(s): Fukuda, R.; Murakami, T.
  • Journal Title: Biological and Pharmaceutical Bulletin Volume: 43 Issue: 4 Pages: 596-607
  • DOI: 10.1248/bpb.b19-00858
  • NAID: 130007825271
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • Year and Date: 2020-04-01
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Elucidation of the Mechanisms for the Underlying Depolarization and Reversibility by Photoactive Molecule. (2020)
  • Author(s): Numata Tomohiro、Fukuda Ryosuke、Hirano Mitsuru、Yamaguchi Kazuma、Sato-Numata Kaori、Imahori Hiroshi、Murakami Tatsuya
  • Journal Title: Cellular Physiology and Biochemistry Volume: 54 Issue: 5 Pages: 899-916
  • DOI: 10.33594/000000277
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Photoregulation of the Membrane Potential of Living Cells with Ferrocene-Porphyrin-Fullerene-Linked Molecules (2023)
  • Author(s): T. Murakami
  • Organizer: 103rd Annual Meeting of the Chemical Society of Japan
  • Invited
• [Presentation] Apolipoprotein A-I由来ペプチドを用いる新規脂質ナノ粒子の作製 (2023)
  • Author(s): Y. Mizukami, R. Kawakami, R. Shima, S. Shibukawa, R. Fukuda, T. Murakami
  • Organizer: The 143rd Annual Meeting of the Japanese Pharmaceutical Society
• [Presentation] The exacerbation mechanism of cardiomyocyte injury by cardiac Sigma-1 receptor knockdown. (2023)
  • Author(s): H. Tagashira, Y. Shinoda, T. Numata, K. Fukunaga
  • Organizer: The 100th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan
• [Presentation] Functional coupling between BK and L-type Ca2+ channels found in cricket oviducts (2023)
  • Author(s): T. Numata, K. Sato-Numata, M. Yoshino
  • Organizer: The 100th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan
• [Presentation] The role of LRRC8D in the regulatory volume decrease in human epithelial cells. (2023)
  • Author(s): K. Sato-Numata, T. Suzuki, A. Sakai, S. Mori, Y. Okada, T. Numata
  • Organizer: The 100th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan
• [Presentation] Elucidation of the water secretion mechanism of Boui-ougi-to and its application to cancer therapeutic agents (2023)
  • Author(s): T. Suzuki, H. Saito, K. Sato-Numata, T. Numata
  • Organizer: The 100th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan
• [Presentation] The regulation mechanisms of mitochondrial Ca2+ signaling mediated by cardiac Sigma-1 receptor (2023)
  • Author(s): H. Tagashira, Y. Shinoda, T. Numata, K. Fukunaga
  • Organizer: The 100th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan
• [Presentation] New role of TRPM7 in cell volume regulation mechanism (2022)
  • Author(s): T. Numata
  • Organizer: The 99th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan
  • Invited
• [Presentation] Photoregulation of the Membrane Potential of Living Cells with Donor-Acceptor-Linked Molecules (2022)
  • Author(s): T. Murakami
  • Organizer: Annual Meeting on Photochemistry 2022
  • Invited
• [Presentation] Corneal epithelial cell affinity and posterior eye drug delivery ability of lipoprotein variants (2022)
  • Author(s): S. Shibukawa, Y. Tsukio, R. Fukuda, T. Murakmi
  • Organizer: MBSJ2022
• [Presentation] 加齢黄斑変性の早期病態改善を目指した網膜内薬物送達法の開発 (2022)
  • Author(s): R. Kawakami, R. Fukuda, K. Suda, E. Nakano, A. Ichioka, A. Tsujikawa, T. Murakami
  • Organizer: MBSJ2022
• [Presentation] 加齢黄斑変性の早期病態改善を目指した網膜内薬物送達法の開発 (2022)
  • Author(s): T. Ohashi, R. Fukuda, S. Shibukawa, T. Murakami
  • Organizer: 第71回高分子学会北陸支部研究発表会
• [Presentation] Photoregulation of the Membrane Potential of Living Cells with Donor-Acceptor-Linked Molecules (2021)
  • Author(s): T. Murakami
  • Organizer: Annual Meeting on Photochemistry 2022
  • Invited
• [Presentation] ゼブラフィッシュによるリポタンパク質の体内動態評価 (2021)
  • Author(s): R. Shima, R. Fukuda, S. Shibukawa, Y. Mizukami, R. Kawakami, F. Kawanishi, J. Huwyler, T. Murakami
  • Organizer: The 37th Annual Meeting og the Japan Society of Drug Delivery System
• [Presentation] アクティブターゲティング能を付与した治療用ナノ粒子の作製と生物活性評価 (2021)
  • Author(s): R. Kawakami, R. Fukuda, F. Kawanishi, M. Ogura, T. Murakami
  • Organizer: The 37th Annual Meeting og the Japan Society of Drug Delivery System
• [Presentation] CD13リガンドと細胞膜透過ペプチドを含む人工HDL点眼剤の可能性 (2021)
  • Author(s): R. Fukuda, M. Nargis, R. Kawakami, Y. Nagai, E. Nakano, K. Suda, A. Tsujikawa, T. Murakami
  • Organizer: The 37th Annual Meeting og the Japan Society of Drug Delivery System
• [Presentation] リポタンパク質の変異体化による生物活性の増強とそのメカニズムの検討 (2020)
  • Author(s): 福田 亮介、河上 亮、河西 文武、小倉 正恒、村上 達也
  • Organizer: 第15回トランスポーター研究会年会Web
• [Presentation] One-Step Preparation and Freeze-Drying of Drug-loaded Protein/Lipid Nanocomposites (2020)
  • Author(s): Ryosuke FUKUDA, Mio SAITO, Rumina SHIMA, Shiori SHIBUKAWA, Ayumi SUMINO, Minoru NAKANO, and Tatsuya MURAKAMI
  • Organizer: CRS2020 Virtual Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Doubly modified lipoprotein mutant for the eye drop treatment of age-related macular degeneration (2020)
  • Author(s): Sawangrat KASIRAWAT, Ryosuke FUKUDA, Kenji SUDA, Eri NAKANO, Akitaka TSUJIKAWA, Tatsuya MURAKAMI
  • Organizer: 日本薬学会第140年会Web
• [Book] 新規モダリティ医薬品のための新しいDDS技術と製剤化（第６章、第９節） (2022)
  • Author(s): 村上 達也、澁川 しおり
  • Total Pages: 9
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861049361
• [Remarks] 富山県立大学村上研究室ＨＰ
  • URL: https://www.pu-toyama.ac.jp/BR/murakami/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 薬物デリバリーキャリアおよびこれを用いる医薬組成物 (2020)
  • Inventor(s): 村上 達也、サウェンラット カシラワット、福田 亮介、他４名
  • Industrial Property Rights Holder: 富山県立大学，京都大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2020-036022
  • Filing Date: 2020