Studies on critical periods of synapse pruning in the developing cerebellum

• Project Area: Inducing lifelong plasticity (iPlasticity) by brain rejuvenation: elucidation and manipulation of critical period mechanisms
• Project/Area Number: 20H05915
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Teikyo University (2023-2024); The University of Tokyo (2020-2022)
• Principal Investigator: 狩野 方伸 帝京大学, 先端総合研究機構, 教授 (40185963)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 菅谷 佑樹 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (00625759)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥169,520,000 (Direct Cost: ¥130,400,000、Indirect Cost: ¥39,120,000); Fiscal Year 2024: ¥30,420,000 (Direct Cost: ¥23,400,000、Indirect Cost: ¥7,020,000); Fiscal Year 2023: ¥30,420,000 (Direct Cost: ¥23,400,000、Indirect Cost: ¥7,020,000); Fiscal Year 2022: ¥30,420,000 (Direct Cost: ¥23,400,000、Indirect Cost: ¥7,020,000); Fiscal Year 2021: ¥28,860,000 (Direct Cost: ¥22,200,000、Indirect Cost: ¥6,660,000); Fiscal Year 2020: ¥49,400,000 (Direct Cost: ¥38,000,000、Indirect Cost: ¥11,400,000)
• Keywords: シナプス刈り込み / 生後発達 / 小脳 / 登上線維 / プルキンエ細胞

Outline of Research at the Start

シナプス刈り込みは発達期の神経系において普遍的にみられ、大人の神経回路を作るための仕組みと考えられている。小脳の登上線維とプルキンエ細胞間のシナプスの生後発達は、シナプス刈り込みの代表例として広く認知されている。出生直後のマウス小脳のプルキンエ細胞は、5本以上の登上線維からほぼ同じ強さのシナプス入力を受けるが、このうち1本の登上線維からの入力のみが強くなり、その他の登上線維は除去されて、大人になると殆どのプルキンエ細胞が1本の強い登上線維からシナプス入力を受けるようになる。本研究では、これらの過程の分子細胞レベルおよび神経回路レベルのメカニズムを追求し、シナプス刈り込みの臨界期の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

令和4年度は、引き続き、転写因子Myocyte enhancer factor 2 (MEF2) familyのうち、プルキンエ細胞に強く発現する分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスを解析した。その結果、登上線維の樹状突起への進展が軽度に障害されており、プルキンエ細胞の細胞体に余剰な登上線維シナプスが残存していることが明らかになった。一方、平行線維からの興奮性シナプス入力や抑制性シナプス入力に異常は見られなかった。また、小脳のRNA-sequencingを行った結果、プルキンエ細胞特異的KOマウスにおいて、9個の遺伝子が有意な発現低下を示し、62個の遺伝子が有意な発現上昇を示した。さらに、プルキンエ細胞に強く発現する転写因子MEF2 familyのうちで、上記とは別の分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスを解析した。その結果、生後20日から30日において、2本以上の登上線維によって支配されるプルキンエ細胞の割合が野生型マウスに比べて有意に高いことが判明したが、生後15日までは異常が認められなかったことから、生後16日以降の登上線維シナプス刈り込みに異常があることが考えられた。
また、プルキンエ細胞においてP/Q型電位依存性カルシウムチャネル(P/Q-VDCC)によって活性化されると考えられるMEF2 familyとは別の転写因子の解析を継続した。この転写因子をプルキンエ細胞特異的にノックダウン（KD）すると生後2週目後半から3週目の後期刈り込み過程が障害され、登上線維の樹状突起へのシナプス領域の拡大の程度が弱くなるが、これらがP/Q-VDCCと同じ分子パスウェイを介することを示す結果を得た。また、この転写因子をKDした小脳では、一部のセマフォリンの発現が上昇しており、このセマフォリンをプルキンエ細胞で過剰発現すると、転写因子のKDと同様の登上線維シナプス刈り込みの異常を生じた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和4年度は8月まで、COVID-19の感染の広がりがあったが、秋以降には感染状況は好転し、研究への影響は軽微となった。プルキンエ細胞に発現するMEF2 family分子のうち、令和2年から解析していた分子については、この分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスの登上線維シナプス刈り込みに関する電気生理学的および形態学的解析をほぼ終了した。また、もう一つのMEF2 family分子についても、そのプルキンエ細胞特異的KOマウスの電気生理学的解析がほぼ終了し、形態学的データを取得済みであり、今後その解析を進めることになる。プルキンエ細胞においてP/Q-VDCCによって活性化されるMEF2 familyとは別の転写因子の登上線維シナプス除去における役割についての研究は、予定をやや上回るペースで進んでいるといえる。特に、この転写因子が一部のセマフォリンの発現を抑制することによって登上線維シナプス除去を促進していると考えられる結果を得たことは、これまで知られていたセマフォリンの登上線維シナプス発達への作用とP/Q-VDCCを介するカルシウム流入との関係を明らかにしたことになり、大きな進歩と考えられる。

Strategy for Future Research Activity

MEF2 family転写因子の登上線維シナプス刈り込みにおける役割については予定した解析をほぼ終了した。今後は、当該分子のプルキンエ細胞特異的ノックアウトマウスの網羅的行動解析に注力する。一方、プルキンエ細胞においてP/Q-VDCCによって活性化されると考えられる転写因子の役割についてさらに研究を進める。この転写因子をKDした小脳で発現が上昇しているセマフォリンの過剰発現と当該転写因子のKDを同時に行った場合、登上線維シナプス刈り込みがどのようになるかを調べる。また、このセマフォリンのプルキンエ細胞でのKDが当該転写因子のKDの効果を軽減するかどうかを調べる。
今後、新たにシナプスオーガナイザー分子の登上線維シナプス発達における役割に注目する。シナプスオーガナイザーは、細胞外ドメインを介して選択的相互作用をすることで、シナプス前部と後部をマッチングさせてシナプス形成を誘導する一群の分子で、このうち、LAR-RPTPsはシナプス前部オーガナイザーである。申請者らの予備的実験で、LAR-RPTPsに属する分子のノックアウト（KO）マウスでは、登上線維の樹状突起移行が明らかに障害されていることが示唆されている。そこで、この分子の局在を免疫組織学的手法で調べ、小脳の部位（小脳小葉）の違いによって登上線維の樹状突起移行に差があるかを明らかにする。さらに、このKOマウスにおいて登上線維シナプス除去に異常がみられるかを、新生児期から生後4週目まで網羅的に調べるとともに、登上線維からプルキンエ細胞へのシナプス応答を電気生理学的に精査する。並行して、microRNAによってこの分子を登上線維特異的にKDすることを試みる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ミュンヘン工科大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ミュンヘン工科大学(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] ミュンヘン工科大学(ドイツ)
• [Journal Article] mGluR5 Is Substitutable for mGluR1 in Cerebellar Purkinje Cells for Motor Coordination, Developmental Synapse Elimination, and Motor Learning (2022)
  • Author(s): Harbers Maria、Nakao Harumi、Watanabe Takaki、Matsuyama Kyoko、Tohyama Shoichi、Nakao Kazuki、Kishimoto Yasushi、Kano Masanobu、Aiba Atsu
  • Journal Title: Cells Volume: 11 Issue: 13 Pages: 2004-2004
  • DOI: 10.3390/cells11132004
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Endocannabinoid-dependent formation of columnar axonal projection in the mouse cerebral cortex (2022)
  • Author(s): Itami Chiaki、Uesaka Naofumi、Huang Jui-Yen、Lu Hui-Chen、Sakimura Kenji、Kano Masanobu、Kimura Fumitaka
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 37
  • DOI: 10.1073/pnas.2122700119
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Endocannabinoid-Mediated Control of Neural Circuit Excitability and Epileptic Seizures (2022)
  • Author(s): Sugaya Yuki、Kano Masanobu
  • Journal Title: Frontiers in Neural Circuits Volume: 15 Pages: 781113-781113
  • DOI: 10.3389/fncir.2021.781113
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A Flp-dependent G-CaMP9a transgenic mouse for neuronal imaging in?vivo (2022)
  • Author(s): Sakamoto Masayuki, Inoue Masatoshi, Takeuchi Atsuya, Kobari Shigetaka, Yokoyama Tatsushi, Horigane Shin-ichiro, Takemoto-Kimura Sayaka, Abe Manabu, Sakimura Kenji, Kano Masanobu, Kitamura Kazuo, Fujii Hajime, Bito Haruhiko
  • Journal Title: Cell Reports Methods Volume: 2 Issue: 2 Pages: 100168-100168
  • DOI: 10.1016/j.crmeth.2022.100168
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Combined glyoxalase 1 dysfunction and vitamin B6 deficiency in a schizophrenia model system causes mitochondrial dysfunction in the prefrontal cortex (2021)
  • Author(s): Toriumi Kazuya、Berto Stefano、Koike Shin、Usui Noriyoshi、Dan Takashi、Suzuki Kazuhiro、Miyashita Mitsuhiro、Horiuchi Yasue、Yoshikawa Akane、Asakura Mai、Nagahama Kenichiro、Lin Hsiao-Chun、Sugaya Yuki、Watanabe Takaki、Kano Masanobu、Ogasawara Yuki、Miyata Toshio、Itokawa Masanari、Konopka Genevieve、Arai Makoto
  • Journal Title: Redox Biology Volume: 45 Pages: 102057-102057
  • DOI: 10.1016/j.redox.2021.102057
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Carbon powder-filled microelectrode: An easy-to-fabricate probe for cellular electrochemistry (2021)
  • Author(s): Tsujimura Asuka、Kamae Yuhi、Kawasaki Hikaru、Nagai Haruki、Kano Masanobu、Tabata Toshihide
  • Journal Title: Analytical Biochemistry Volume: 629 Pages: 114316-114316
  • DOI: 10.1016/j.ab.2021.114316
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] mGluR1 signaling in cerebellar Purkinje cells: Subcellular organization and involvement in cerebellar function and disease (2021)
  • Author(s): Yamasaki Miwako、Aiba Atsu、Kano Masanobu、Watanabe Masahiko
  • Journal Title: Neuropharmacology Volume: 194 Pages: 108629-108629
  • DOI: 10.1016/j.neuropharm.2021.108629
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Calcium imaging of adult-born neurons in freely moving mice (2021)
  • Author(s): Carrier-Ruiz Alvaro、Sugaya Yuki、Kumar Deependra、Vergara Pablo、Koyanagi Iyo、Srinivasan Sakthivel、Naoi Toshie、Kano Masanobu、Sakaguchi Masanori
  • Journal Title: STAR Protocols Volume: 2 Issue: 1 Pages: 100238-100238
  • DOI: 10.1016/j.xpro.2020.100238
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Combining electrophysiology and optogenetics for functional screening of pyramidal neurons in the mouse prefrontal cortex (2021)
  • Author(s): Nagahama Kenichiro、Fujino Shuhei、Watanabe Takaki、Uesaka Naofumi、Kano Masanobu
  • Journal Title: STAR Protocols Volume: 2 Issue: 2 Pages: 100469-100469
  • DOI: 10.1016/j.xpro.2021.100469
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vivo genome editing in single mammalian brain neurons through CRISPR-Cas9 and cytosine base editors (2021)
  • Author(s): Song Beomjong、Kang Chan Young、Han Jun Hee、Kano Masanobu、Konnerth Arthur、Bae Sangsu
  • Journal Title: Computational and Structural Biotechnology Journal Volume: 19 Pages: 2477-2485
  • DOI: 10.1016/j.csbj.2021.04.051
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] An Autism-Associated Neuroligin-3 Mutation Affects Developmental Synapse Elimination in the Cerebellum (2021)
  • Author(s): Lai Esther Suk King、Nakayama Hisako、Miyazaki Taisuke、Nakazawa Takanobu、Tabuchi Katsuhiko、Hashimoto Kouichi、Watanabe Masahiko、Kano Masanobu
  • Journal Title: Frontiers in Neural Circuits Volume: 15 Pages: 676891-676891
  • DOI: 10.3389/fncir.2021.676891
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phospholipase C β3 is required for climbing fiber synapse elimination in aldolase C-positive compartments of the developing mouse cerebellum (2020)
  • Author(s): Rai Yurie、Watanabe Takaki、Matsuyama Kyoko、Sakimura Kenji、Uesaka Naofumi、Kano Masanobu
  • Journal Title: Neuroscience Volume: 462 Pages: 36-43
  • DOI: 10.1016/j.neuroscience.2020.04.035
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Calcium-Dependent Regulation of Climbing Fiber Synapse Elimination in the Developing Cerebellum (2023)
  • Author(s): Masanobu Kano
  • Organizer: IRCN-iPlasticity International Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 神経活動に依存したシナプス刈り込みによる成熟神経回路の形成 (2023)
  • Author(s): 狩野 方伸
  • Organizer: 日本生理学会第100回記念大会
  • Invited
• [Presentation] 小脳における発達期シナプス刈り込みの活動依存的制御 (2022)
  • Author(s): 狩野 方伸
  • Organizer: 第45回日本神経科学大会（NEURO2022,）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 神経発火異常を引き起こす巨大スパインの非線形コンピュテーション (2022)
  • Author(s): 小尾（永田） 紀翔、鈴木 紀光、Matthew L. MacDonald、Kenneth N. Fish、白井 福寿、沖村 宰、長濱 健一郎、田中 昌司、狩野 方伸、Robert A. Sweet、林（高木） 朗子
  • Organizer: 第45回日本神経科学大会（NEURO2022,）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 小脳プルキンエ細胞特異的なmGluR5の発現はmGluR1の運動協調およびシナプス刈り込みの機能を代替できる (2022)
  • Author(s): ハーベス まりあ、中尾 晴美、渡邉 貴樹、岸本 泰司、狩野 方伸、饗場 篤
  • Organizer: 第45回日本神経科学大会（NEURO2022,）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Diacylglycerol lipase-α ノックアウトマウスにみられる早期眼優位可塑性への抑制性神経回路の関与 (2022)
  • Author(s): 亀山 克朗、米田 泰輔、後藤 隆浩、寺田 慧子、高木 正浩、吉村 由美子、崎村 建司、狩野 方伸、畠 義郎
  • Organizer: 第45回日本神経科学大会（NEURO2022,）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Calcium-dependent regulation of climbing fiber synapse elimination in the developing cerebellum (2022)
  • Author(s): Masanobu Kano
  • Organizer: The 12th International Symposium of the RESEARCH ON THE CEREBELLUM AND ATAXIAS (SRCASRCA2022)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Endocannabinoid-dependent formation of columnar axonal projection of layer 4 neurons in the mouse cerebral cortex (2022)
  • Author(s): Chiaki Itami, Naofumi Uesaka, Jui-Yen Huang, Hui-Chen Lu, Kenji Sakimura, Masanobu Kano, Fumitaka Kimura
  • Organizer: 第99回日本生理学会大会
• [Presentation] 自由行動下で記憶想起課題中のマウス歯状回顆粒細胞の活動 (2021)
  • Author(s): 菅谷 佑樹、Ruiz Alvaro、狩野 方伸
  • Organizer: 第44回日本神経科学大会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 発達期小脳においてプレシナプスのLAR-RPTPsはプルキンエ細胞樹状突起上の登上線維シナプス領域の拡大を促進する (2021)
  • Author(s): 奥野 優人、渡邉 貴樹、佐郡 和人、狩野 方伸
  • Organizer: 第44回日本神経科学大会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 自発レバー引き課題を行うマウスにおける小脳プルキンエ細胞の複雑スパイク活動の符号化モデル解析 (2021)
  • Author(s): 池添 貢司、日高 直樹、真仁田 聡、村上 誠祥、堤 新一郎、礒村 宜和、狩野 方伸、喜多村 和郎
  • Organizer: 第44回日本神経科学大会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 脳の機能発達を担うシナプス刈り込みのアストロサイト依存性とその分子基盤 (2021)
  • Author(s): 上阪 直史、赤松 翼、狩野 方伸
  • Organizer: 第44回日本神経科学大会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生後小脳発達と社会性行動に関わる自閉症感受性遺伝子AUTS2の生理機能の解明 (2021)
  • Author(s): 堀 啓、山城 邦比古、Esther Lai、青木 瞭、嶋岡 可純、有村 奈利子、江草 早紀、坂本 亜沙美、阿部 学、崎村 健司、渡邊 貴樹、上坂 直史、狩野 方伸、星野 幹雄
  • Organizer: 第44回日本神経科学大会
  • Int'l Joint Research