Functions and mechanisms of reguratory nascent chains
| Project Area | Multifaceted Proteins: Expanding and Transformative Protein World |
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| Project/Area Number |
20H05926
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
千葉 志信 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (20523517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内藤 哲 北海道大学, 農学研究院, 農学研究院研究員 (20164105)
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| Project Period (FY) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥177,190,000 (Direct Cost: ¥136,300,000、Indirect Cost: ¥40,890,000)
Fiscal Year 2022: ¥31,330,000 (Direct Cost: ¥24,100,000、Indirect Cost: ¥7,230,000)
Fiscal Year 2021: ¥29,770,000 (Direct Cost: ¥22,900,000、Indirect Cost: ¥6,870,000)
Fiscal Year 2020: ¥53,950,000 (Direct Cost: ¥41,500,000、Indirect Cost: ¥12,450,000)
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| Keywords | 機能性新生鎖 / 翻訳アレスト / リボソーム / 新生鎖 / 非典型的翻訳動態 |
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| Outline of Research at the Start |
典型的なタンパク質は、合成後に立体構造を形成することがその働きに必須である。一方、本研究で対象としている機能性翻訳途上鎖は合成の途上で生理機能を発揮するという点で典型的なタンパク質と異なる。本研究では、機能性翻訳途上鎖の分子機構と生理機能を解明し、それを通じてタンパク質の機能様式のもつ多面性（マルチファセット）を理解することを目指す。そのためには、様々な機能性翻訳途上鎖に共通の特徴である「タンパク質合成（翻訳）の一時停止現象」の分子メカニズムを理解することが重要である。そこで、本研究では、遺伝学や生化学などの手法を駆使し、翻訳の一時停止現象の分子機構の解明を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、新生鎖の状態で、制御された翻訳アレストという機構を用い、細胞内環境をモニタリングし、遺伝子発現制御を介して細胞の機能を調節する「機能性新生鎖」の生理機能と分子機構の解明を目指している。
代表者・千葉は、放線菌由来のアレスト因子ApcA、ApdA、および、根粒菌由来のApdPについて、大腸菌および枯草菌を宿主とし、網羅的な変異解析を行った。その結果、これら三者に類似のアミノ酸配列の重要性が浮上した。このことは、これらの因子が部分的に共通の機構を介して翻訳アレストを起こす可能性があることを示唆している。また、この類似モチーフの変異解析から、いずれの場合も、モチーフ内の共通の残基が他のアミノ酸残基に置換不可能であることが分かり、その残基の翻訳アレストにおける重要性が示唆された。一方、枯草菌のリボソームを改変したオルソゴナル翻訳系の構築に成功した。このオルソゴナル翻訳系の確立により、枯草菌において、リボソームタンパク質のみならず、リボソームRNAの変異解析が可能になるものと期待される。
分担者・内藤は、真核生物における「機能性新生鎖」の生理機能と分子機構の解明に資する研究材料として、変異型リボソームのみを発現するトランスジェニックシロイヌナズナの作出を継続して実施した。リボソームタンパク質uL4およびuL22について、外来遺伝子として変異型リボソームを発現させるための方策として、2コピーの変異型遺伝子を安定して発現させられる発現ベクターを新たに作出し、無細胞翻訳系とタバコ葉の一過的発現系でうまく機能することが明らかになった。また、コムギ胚芽抽出液の無細胞翻訳系を用いて、植物・動物・ウイルスを含めた真核生物で知られている翻訳アレスト配列におけるリボソーム停滞の生化学的解析を行い、翻訳アレストを生化学的に記述するとともに、その性状と生理学的機能の関係を考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
千葉は、ApcA、ApdA、ApdPの変異解析から、アレスト因子の分子機構や分子進化に関連した興味深い知見が得られた。また、リボソームRNAの変異解析に有用な枯草菌のオルソゴナル翻訳系の確立に成功した。
内藤は、リボソームタンパク質uL4およびuL22に変異を導入したシロイヌナズナ株の作出のために、2コピーのリボソームタンパク質を安定して発現させることに成功した。また、無細胞翻訳系における翻訳アレストを生化学的に記述する実験系の構築に成功した。
以上の成果が得られたことから、研究計画がおおむね順調に進行していると判断出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
千葉は、放線菌由来のApcA、ApdAについて、天然の宿主である放線菌を用いて、これらが下流遺伝子の制御に関与しているか否か、また、もしそうであれば、どのようなメカニズムでそれがなされているのかについて、放線菌のレポーター株などを構築し、遺伝学的に解析する。また、放線菌リボソームを用いた試験管内翻訳系を構築し、これらのアレスト因子の生化学的な解析を行う。さらに、変異解析が容易な枯草菌オルソゴナル翻訳系を用い、ApcA、ApdA、ApdPの翻訳アレストに重要な役割を果たすリボソームRNAの残基を同定し、これらのアレスト因子とリボソームとの相互作用について、遺伝学的に解析する。
内藤は、これまでに確立した発現ベクターをタバコ葉における一過的発現系に適用して、リボソームタンパク質uL4およびuL22に導入する変異の種類を検討する。当該リボソームタンパク質のリボソームへの取り込み効率から、機能性新生鎖の解析に適した変異の種類を決定する。変異の決定後は上記の発現ベクターを用いてトランスジェニックシロイヌナズナの作出を開始する。実験可能となる2世代目の植物から、表現系・生理応答解析、翻訳アレストの評価のための一過的発現解析と細胞翻訳系における解析を実施する。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)
