Genome modality in interphase genome structure

Planned Research

Project Area	Genome modality: understanding physical properties of the genome
Project/Area Number	20H05937
Research Category	Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Transformative Research Areas, Section (III)
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	西山朋子名古屋大学, 理学研究科, 教授 (90615535)
Project Period (FY)	2020-11-19 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥156,000,000 (Direct Cost: ¥120,000,000、Indirect Cost: ¥36,000,000) Fiscal Year 2022: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000) Fiscal Year 2021: ¥27,560,000 (Direct Cost: ¥21,200,000、Indirect Cost: ¥6,360,000) Fiscal Year 2020: ¥41,080,000 (Direct Cost: ¥31,600,000、Indirect Cost: ¥9,480,000)
Keywords	クロマチン高次構造 / SMC / クロマチン高次構造形成 / コヒーシン / 間期クロマチン構造
Outline of Research at the Start	本研究では、長大なDNAが微小核内に収納されるしくみを解明するため、DNAループ形成に着目する。DNAループ形成を司ると考えられているのがSMCタンパク質複合体であるが、そのDNAループ形成機構は未だに明らかになっていない。本研究では、SMCタンパク質複合体の一つであるコヒーシンが間期核内でDNAをコンパクトに束ねてメゾスケールゲノム構を作りあげる仕組みを解明する。特にDNAの物性変化に着目し、剛直なdsDNAをループ状に変化させるメカニズムを明らかにする。さらに、この仕組みとコヒーシン病変異との関連性を検証することで、メゾスケールから疾患につながるゲノムモダリティ制御を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	長大なDNAをいかにして微小な核内に収納させるのかは、真核生物における重要な問いである。その一つの答えはヒストンによるDNAの巻き付けであるが、それに対し近年、DNAループ形成という全く異質のDNA構造がクロマチン高次構造形成に重要であることが分かってきている。このDNAループ形成を司ると考えられているのが、原核生物からヒトまで保存されているSMC（structural maintenance of chromosomes）タンパク質複合体である。本研究では、SMCタンパク質複合体の一つであるコヒーシンが間期核内でDNAをコンパクトに束ねてメゾスケールゲノム構造を作りあげる仕組みを解明することを目指す。とくにコヒーシンが作るDNAループ構造に着目し、その形成メカニズムを明らかにする。初年度である2020年度はin vitro 一分子DNAループ形成解析系の構築と使用するタンパク質の精製に着手した。ヒトのコヒーシン複合体と、そのローディングに必要なコヒーシンローダーNIPBL/Mau2複合体を昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系を用いて発現、精製し、これらのタンパク質複合体で、全反射顕微鏡を用いて、DNAループ形成が一分子レベルで観察できる系を構築した。DNAループ形成におけるコヒーシンの機能を明らかにするために、コヒーシンとDNAが接触する可能性の高いアミノ酸残基、およびコヒーシン病で報告のあるアミノ酸残基を手がかりに、これらの残基に変異を導入したコヒーシン複合体のDNAループ形成能を検証する予定である。このためのコンストラクションおよびタンパク質精製、これらの変異体を発現する培養細胞の作製に着手した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究で用いる全ての複合体遺伝子はMulti-Bacを用いた発現系で発現・精製する。Multi-Bacの作製は複数の遺伝子を1つの巨大なプラスミドに組み込む方法で行われるため、通常のプラスミド作製よりも時間を要する。初年度は複数の変異体のコンストラクト作製および、系の構築を行う予定であった。一分子ループ押出し系の構築やコンストラクト作製、発現細胞作製に着手しており、おおむね順調と判断する。
Strategy for Future Research Activity	変異体の発現、精製、蛍光標識をすすめ、これらの変異体の一分子DNAループ形成能を、ループ形成速度・頻度・ループ維持時間・ATPase活性を指標に検証する。また、コヒーシンの分子内構造変化とループ形成機能を関連づけ、ループ形成メカニズムを明らかにするために、コヒーシン分子内FRETの系を構築する。