Formation of fish fins by assembly of collagen needle-like crystals

• Project Area: Material properties determine body shapes and their constructions
• Project/Area Number: 20H05943
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 近藤 滋 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 教授 (10252503)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥104,910,000 (Direct Cost: ¥80,700,000、Indirect Cost: ¥24,210,000); Fiscal Year 2024: ¥23,010,000 (Direct Cost: ¥17,700,000、Indirect Cost: ¥5,310,000); Fiscal Year 2023: ¥23,010,000 (Direct Cost: ¥17,700,000、Indirect Cost: ¥5,310,000); Fiscal Year 2022: ¥23,010,000 (Direct Cost: ¥17,700,000、Indirect Cost: ¥5,310,000); Fiscal Year 2021: ¥21,840,000 (Direct Cost: ¥16,800,000、Indirect Cost: ¥5,040,000); Fiscal Year 2020: ¥14,040,000 (Direct Cost: ¥10,800,000、Indirect Cost: ¥3,240,000)
• Keywords: ゼブラフィッシュ / ヒレ / コラーゲン / 形態形成 / アクチノトリキア / 配向 / ヒレ骨 / 間葉系細胞 / アクチノジン / 進化 / 鰭 / 可視化 / 建築資材 / シミュレ―ション

Outline of Research at the Start

魚類ヒレの先端には、アクチノトリキアと呼ばれるコラーゲンの棒状結晶体を、ヒレの細胞が「建築資材」のように扱い、分業体制で、作成・整列・骨化を行うことで、ヒレ骨パターンを作り上げている。本申請研究では、その過程の完全な理解、インビトロにおける再現、計算機シミュレーションによるインシリコ再構成により、これまで不明であった後期形態形成現象の新たな概念を創出し将来の再生医療の基礎を作ることを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

（繰り越しの原因となっていた課題。）繰り越しの原因になっていたアクチノトリキア配列の数理モデル化に関しては、現在、３Dでのやや縮約したモデルでのシミュレーションが成功している。インビトロでの、アクチノトリキア2本と間葉系細胞の相互作用を再現したもので、角度をつけて配置したアクチノトリキアを、間葉系細胞がホールドし、膜の力学特性により平行に並べるさまが再現されている。今後は、このモデルにさらに基底上皮膜を加え、より、現実に近いシミュレーションを目指す。
今年度は、意図していなかったが、非常に画期的かつ研究の大きな進展をもたらすと思われる発見があった。アクチノトリキア形成に必須な遺伝子であるアクチノジン１，２の両方をノックダウンしたときに、アクチノトリキアがヒレに対して垂直に配向するという、全く予想しない形質が現れたことである。ヒレ特有のコラーゲンであるアクチノトリキアの特徴は、一本一本が、平行に、平面的に配向することである。一方、通常の表皮のコラーゲン分子は、それぞれが垂直に交わることで、面としての剛性を担保しており、さらに、表皮よりも内部のコラーゲンは、表皮に対してZ方向に直行することで、立体的な剛性を担保する。この直交するという性質は、コラーゲン分子が本来持つものであり、不思議なことに、魚類のヒレのみにおいて失われている。今回、アクチノジン遺伝子のKOで、アクチノトリキアが直交したということは、アクチノジンの機能が、コラーゲンの直交を阻害することであることを示唆し、それはすなわち、ヒレという平面構造を進化させるキーの要因であったことを示している。現在、アクチノジンKOの安定な系統を作成し、さらに詳細な解析を進めている。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

概要にも記したように、アクチノジンKOにより、アクチノトリキアが直交するという、極めて興味深い形質が出現したことにより、2つの方向で、研究が大きく伸展する可能性が出てきた。
まず、一つ目は、進化的な側面である。通常の表皮のコラーゲン分子は、それぞれが垂直に交わることで、面としての剛性を担保しており、さらに、表皮よりも内部のコラーゲンは、表皮に対してZ方向に直行することで、立体的な剛性を担保する。この直交するという性質は、コラーゲン分子が本来持つものであり、不思議なことに、魚類のヒレのみにおいて失われている。今回、アクチノジン遺伝子のKOで、アクチノトリキアが直交したということは、アクチノジンの機能が、コラーゲンの直交を阻害することであることを示唆し、それはすなわち、ヒレという平面構造を進化させるキーの要因であったことを示している。今後、アクチノジンを、通常はコラーゲンが直交している部位に異所的に発現させることで、アクチノトリキア以外のコラーゲン繊維の配向性に対して、どの様な影響を与えるかを調べる。また、薄いヒレを持たない魚類に対しても同様の操作を行うことで、アクチノジンの進化的な意義を調べていく。
もう一つの重要な点は、この変異体を使うことで、コラーゲンを直交させるための物理的な原理を調べることができるようになったことである。変異体で直交するということは、直交しない通常のヒレのアクチノトリキアを「ネガティブコントロール」として使えることを意味する。今後、この系統を確立し詳細な解析を進めることができる。

Strategy for Future Research Activity

以下の3つの研究を中心的に行う。
（１）アクチノトリキアが平面に並ぶ（直交しない）原理の解明：この項目は、学術変革A全体の目的に非常に近いため、最も注力する予定である。アクチノジン１，２KO個体のヒレにおいて、アクチノジン、間葉系細胞、骨芽細胞、破骨細胞をそれぞれ染色し、それ等の立体構造をFIB-SEMで解析し、どの様な物理的相互作用があるのかを調べることと、高解像度顕微鏡により動画を撮影することで、垂直配向の仕組みを解析する。これまでに、垂直に配向するアクチノトリキアは、どれも５～１０本の束になる、束の間の距離がほぼ一定になる、束の隙間には、カラム状の形態をした間葉系細胞が沿うように配置する、事が解っており、細胞の力学的な動態がキーになっていることが示唆されている。
（２）アクチノトリキアの平面上の配列原理の解明：この項目は前年度からの継続である。アクチノトリキアは、最初、ヒレの縁に均等に並んでいるが、やや内側では、将来ヒレ骨ができる部位のみが存在し、それ以外の部位では消失する。この部分的な消失の原理を明らかにしたい。また、アクチノトリキアの先端部への移動、および、部分的消滅の様子を動画で撮影することに成功しているため、それらの詳細を更に調べることも重要である。
（３）ヒレの進化とアクチノトリキアの配向性の関係：上記の通り、アクチノトリキア（コラーゲン繊維）が平行に並び、直交しないことは、魚類のヒレに限られることであり、アクチノジンとヒレの進化の関係は非常に興味深い。ゼブラフィッシュにおけるアクチノジンの異所的発現と、ハイギョ等の平面的なヒレの存在しない魚種への遺伝子導入により、アクチノトリキア以外のコラーゲンに変化が起きることを期待している。

Research Products

• [Journal Article] Mechanical role of actinotrichia in shaping the caudal fin of zebrafish (2021)
  • Author(s): Hibiki Nakagawa, Junpei Kuroda, Toshihiro Aramaki and Shigeru Kondo
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: 481 Pages: 52-63
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2021.09.003
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Three-dimensional topology optimization model to simulate the external shapes of bone (2021)
  • Author(s): Sakashita M, Yamasaki S, Yaji K, Kawamoto A, Kondo S.
  • Journal Title: PLoS Comput Biol . Volume: - Issue: 6 Pages: 16-17
  • DOI: 10.1371/journal.pcbi.1009043
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] A novel cellular mechanism of collagen remodeling in the morphogenesis of fish fin bones revealed by 4D live imaging (2022)
  • Author(s): 黒田 純平
  • Organizer: 第55回日本発生生物学会大会
• [Presentation] Regulation of collagen structure in zebrafish bone and dynamics of bone relating cells (2022)
  • Author(s): 日野 太夢
  • Organizer: 第55回日本発生生物学会大会
• [Presentation] A novel mechanism of collagen remodeling in fish fin bone morphogenesis revealed by 4D live imaging (2022)
  • Author(s): 黒田 純平
  • Organizer: 第54回結合組織学会学術大会
• [Presentation] Analyze collagen structure dynamics during bone formation in zebrafish (2022)
  • Author(s): 日野 太夢
  • Organizer: 第54回結合組織学会学術大会
• [Presentation] 透明化技術で明らかになった軟体動物翼足類の翼における筋肉繊維とコラーゲン繊維の階層的なネットワーク (2022)
  • Author(s): 黒田 純平
  • Organizer: 日本動物学会 第93回早稲田大会2022
• [Presentation] ゼブラフィッシュとカエデイソヤムシのヒレの形態形成を支える細胞骨格動態の i n vivoイメージング (2022)
  • Author(s): 黒田 純平
  • Organizer: 令和4年度ヤムシ研究会
• [Presentation] The novel transporting system of the collagen fibers which play as scaffolds for fin bones formation in teleost fish. (2021)
  • Author(s): Junpei Kuroda, Shigeru Kondo
  • Organizer: 日本動物学会
• [Presentation] Morphogenesis of fin bones by the moving cells which translocate large collagen crystals. (2021)
  • Author(s): Junpei Kuroda, Hiromu Hino, Hibiki Nakagawa, Shigeru Kondo
  • Organizer: 日本分子生物学会
• [Remarks] 魚のヒレを建築する「からだ工務店」の作業員
  • URL: https://www.fbs-osaka-kondolabo.net/post/