Bottom-up construction of the de novo cell-membrane system with molecules

• Project Area: Bottom-up creation of cell-free molecular systems: surpassing nature
• Project/Area Number: 21H05229
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (II)
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 川野 竜司 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90401702)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川村 出 横浜国立大学, 大学院工学研究院, 准教授 (20452047)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥141,180,000 (Direct Cost: ¥108,600,000、Indirect Cost: ¥32,580,000); Fiscal Year 2025: ¥22,230,000 (Direct Cost: ¥17,100,000、Indirect Cost: ¥5,130,000); Fiscal Year 2024: ¥22,750,000 (Direct Cost: ¥17,500,000、Indirect Cost: ¥5,250,000); Fiscal Year 2023: ¥22,880,000 (Direct Cost: ¥17,600,000、Indirect Cost: ¥5,280,000); Fiscal Year 2022: ¥25,610,000 (Direct Cost: ¥19,700,000、Indirect Cost: ¥5,910,000); Fiscal Year 2021: ¥47,710,000 (Direct Cost: ¥36,700,000、Indirect Cost: ¥11,010,000)
• Keywords: De novo細胞膜 / 膜分子システム / 電気化学 / マイクロ流体 / 固体NMR / De novo設計 / 人工細胞膜 / ナノポア計測 / 進化工学 / 膜輸送体 / 脂質二分子膜 / マイクロデバイス / 人工二分子膜 / マイクロ工学 / de novo設計 / 合成高分子膜 / 二分子膜 / 無細胞合成 / 膜ペプチド

Outline of Research at the Start

本研究では、タンパク質、核酸、脂質など生物を構成するバイオ分子および、関連化合物を組み合わせ、天然の細胞にはない分子システムをボトムアップに作るための学理を構築することにある。そのために、単なる生細胞の再現ではなく、細胞機能の一部を取り出し、その本来の機能を制御し、応用可能・社会実装可能な超越分子システムを構築する。それを実現するため、変異と選択を繰り返し最適解を得る進化工学と、有機合成、統計科学、デバイス工学など技術を融合させる。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、天然には存在しない人工の細胞膜をボトムアップ的に設計（de novo設計）し、一分子計測や環境中で作動するマイクロロボットの開発を行う。

具体的には、これまでリン脂質で構成されてきた脂質二分子膜部分を両親媒性の人工分子に置きかけ、より高機能な人工細胞膜を構築する。そこに人工的に設計した膜輸送体の組み込みを目指す。例えば、de novo設計したアミノ酸配列のペプチドを、細胞膜を構成する脂質二分子膜中に埋め込むことで、標的分子を検出可能なナノポア（ナノ細孔）や、脂質膜内外の物質輸送を制御可能な膜輸送分子を開発する。また、これら構築したペプチド-脂質膜を分子同士で作るシステムとみなし、進化工学と組み合わせ探索による複数の分子で構成された分子システムの最適化のための学理を構築する。

これまで申請者は、de novo設計ペプチドナノポアによる一分子計測（Nature Nanotech. 2022）や、βアミロイドの神経細胞膜モデル膜でのポア形成機構に関する研究（PNAS Nexus 2024）を行ってきた。本研究では膜の内外を輸送する人工輸送体、および膜自体を工学的に設計再構築する手法について、それぞれの要素の相互作用解析により検討を行う。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究開始から、毎月一度の総括班会議・領域セミナーを開催し、領域の運営、領域内共同研究について打ち合わせを継続して行っている。ジョンズホプキンス大やローマ大（Tor Vergata）から本分野で著名な研究者による国際シンポジウムを開催した。申請者らが構成するC01班では、無細胞膜システムの構築を行っており、de novo設計ペプチド二分子膜の構築、マイクロ流路による細胞サイズリポソームの大量作製、DNAコンピューティングを内包したリポソーム型分子ロボットの開発を目指し研究を進めている。

領域内共同研究として、B01班と新規βバレル膜タンパク質の再構成の試み、B02班と進化工学による膜ペプチドのセレクション、膜輸送体の改変について検討を行い、D01班とは膜輸送体分子と二分子膜構成分子との組み合わせ最適化について議論中である。これらの共同研究に伴い、博士学生の海外派遣、研究員さんのプロモーション活動などを促進している。また第2回目の領域会議・若手の会を高野山＠和歌山で開催し、定期的に領域のニュースレターを発行した。日本生物物理学会年会において領域シンポジウムを組織し、シンポジウム内容についてBPPB誌にCommentaryを発表した。アウトリーチ活動として学部生を中心に行う国際サイエンスプログラムBIOMOD2023をサポートし、サポート学生の成果が銀賞に入賞した。

分担者の川村グループでは、細胞膜分子システムの固体NMR構造解析法の開発を目指して研究を行っている。固体NMRを用いた抗菌ペプチドの動的構造解析やロドプシンの極大吸収波長とシッフ塩基の窒素15の化学シフト相関をさらに深化させた。

Strategy for Future Research Activity

今年度は、マイクロ流体デバイスで作製した細胞サイズリポソームを利用し、癌マーカーを検出し自律的にがん抑制薬剤を合成する人工細胞/分子ロボットを開発する。また膜ペプチドや膜タンパク質ナノポアに関しては、進化工学及び組み合わせ最適化により、高機能なポアのセレクション手法確立を目指す。

川村グループでは、細胞膜分子システムの反応場である水和膜環境において、種々の生体分子同士の分子間相互作用検出のための固体NMR実験技術最適化についてさらに検討を進める。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ジョンズホプキンス大学(米国)
• [Int'l Joint Research] ローマ大学（Tor Vergata）(イタリア)
• [Int'l Joint Research] ケンブリッジ大学/インペリアル・カレッジ・ロンドン(英国)
• [Journal Article] Lipid vesicle-based molecular robots (2024)
  • Author(s): Peng Zugui、Iwabuchi Shoji、Izumi Kayano、Takiguchi Sotaro、Yamaji Misa、Fujita Shoko、Suzuki Harune、Kambara Fumika、Fukasawa Genki、Cooney Aileen、Di Michele Lorenzo、Elani Yuval、Matsuura Tomoaki、Kawano Ryuji
  • Journal Title: Lab on a Chip Volume: 24 Issue: 5 Pages: 996-1029
  • DOI: 10.1039/d3lc00860f
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Long-Term Stable Liposome Modified by PEG-Lipid in Natural Seawater (2024)
  • Author(s): Izumi Kayano、Ji Jiajue、Koiwai Keiichiro、Kawano Ryuji
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 9 Issue: 9 Pages: 10958-10966
  • DOI: 10.1021/acsomega.3c10346
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nanopore Filter: A Method for Counting and Extracting Single DNA Molecules Using a Biological Nanopore (2023)
  • Author(s): Asuka Tada+, Nanami Takeuchi+, Kan Shoji, Ryuji Kawano (+equal contribution)
  • Journal Title: Analytical chemistry Volume: 96 Issue: 26 Pages: 9805-9812
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.3c00573
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Simultaneous Recognition of Over- and Under-Expressed MicroRNAs Using Nanopore Decoding (2023)
  • Author(s): Takiguchi Sotaro、Kambara Fumika、Tani Mika、Sugiura Tsuyoshi、Kawano Ryuji
  • Journal Title: Analytical Chemistry Volume: 95 Issue: 39 Pages: 14675-14685
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.3c02560
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Bottom-up creation of cell-free molecular systems: Basic research toward social implementation (2023)
  • Author(s): Kawamura Izuru、Kawano Ryuji、Matsuura Tomoaki
  • Journal Title: Biophysics and Physicobiology Volume: 20 Issue: 4 Pages: n/a
  • DOI: 10.2142/biophysico.bppb-v20.0042
  • ISSN: 2189-4779
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Real-time monitoring of the amyloid β1-42 monomer-to-oligomer channel transition using a lipid bilayer system (2023)
  • Author(s): Numaguchi Yuri、Tsukakoshi Kaori、Takeuchi Nanami、Suzuki Yuki、Ikebukuro Kazunori、Kawano Ryuji
  • Journal Title: PNAS Nexus Volume: 3 Issue: 1
  • DOI: 10.1093/pnasnexus/pgad437
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dynamic membrane interaction and amyloid fibril formation of glucagon, melittin and human calcitonin (2023)
  • Author(s): Naito Akira、Kawamura Izuru
  • Journal Title: Biophysical Chemistry Volume: 298 Pages: 107025-107025
  • DOI: 10.1016/j.bpc.2023.107025
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Evaluation of the Water Repellency and Structure of Cellulose Nanofibers Derived from Waste Hop Stems Using a Fluoroalkyl Silane Coupling Treatment (2023)
  • Author(s): Yamada Kohei、Kanai Noriko、Kawamura Izuru
  • Journal Title: Waste and Biomass Valorization Volume: 15 Issue: 3 Pages: 1541-1552
  • DOI: 10.1007/s12649-023-02254-w
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] DNAコンピューティング技術とナノポア計測を組み合わせた体液診断技術 (2023)
  • Author(s): 竹内七海、滝口創太郎、神原史佳、川野竜司
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 101 Pages: 435-438
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] マイクロ流体デバイスを用いた細胞サイズリポソームの作製手法 (2023)
  • Author(s): 鈴木春音、髙木里菜、吉家爵、川野竜司
  • Journal Title: 公益社団法人 日本化学会 バイオテクノロジー部会 NEWS LETTER Volume: 27 Pages: 3-10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell-Free Expression of De Novo Designed Peptides That Form β-Barrel Nanopores (2023)
  • Author(s): Fujita Shoko, Kawamura Izuru, Kawano Ryuji
  • Journal Title: ACS Nano Volume: 17 Issue: 4 Pages: 3358-3367
  • DOI: 10.1021/acsnano.2c07970
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Liposome Deformation Induced by Membrane-Binding Peptides (2023)
  • Author(s): Izumi Kayano, Saito Chihiro, Kawano Ryuji
  • Journal Title: Micromachines Volume: 14 Issue: 2 Pages: 373-373
  • DOI: 10.3390/mi14020373
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Construction of nanopores using β-hairpin peptides synthesized by a cell-free system (2023)
  • Author(s): Fujita Shoko, Fukuda Miyu, Mizoguchi Ikuro, Kawamura Izuru, Kawano Ryuji
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 122 Issue: 3 Pages: 367a-367a
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2022.11.2024
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Discrimination of cationic peptides using malaria translocon, EXP2, nanopores (2023)
  • Author(s): Miyagi Mitsuki, Kurokawa Nina, Yohda Masafumi, Kawano Ryuji
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 122 Issue: 3 Pages: 438a-438a
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2022.11.2365
• [Journal Article] Unfolding of β-hairpin and α-helical peptides through a biological nanopore (2023)
  • Author(s): Fukuda Miyu, Kawano Ryuji
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 122 Issue: 3 Pages: 439a-439a
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2022.11.2371
• [Journal Article] Evaluating the Stability of Cellulose Nanofiber Pickering Emulsions Using MRI and Relaxometry (2023)
  • Author(s): Kanai Noriko、Willis Scott A.、Gupta Abhishek、Kawamura Izuru、Price William S.
  • Journal Title: Langmuir Volume: 39 Issue: 11 Pages: 3905-3913
  • DOI: 10.1021/acs.langmuir.2c03201
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Solid-state NMR for the characterization of retinal chromophore and Schiff base in TAT rhodopsin embedded in membranes under weakly acidic conditions (2023)
  • Author(s): Arikawa Sui、Sugimoto Teppei、Okitsu Takashi、Wada Akimori、Katayama Kota、Kandori Hideki、Kawamura Izuru
  • Journal Title: Biophysics and Physicobiology Volume: 20 Issue: Supplemental Pages: n/a
  • DOI: 10.2142/biophysico.bppb-v20.s017
  • ISSN: 2189-4779
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of retinal chromophore and protonated Schiff base in Thermoplasmatales archaeon heliorhodopsin using solid-state NMR spectroscopy (2023)
  • Author(s): Suzuki Shibuki、Kumagai Sari、Nagashima Toshio、Yamazaki Toshio、Okitsu Takashi、Wada Akimori、Naito Akira、Katayama Kota、Inoue Keiichi、Kandori Hideki、Kawamura Izuru
  • Journal Title: Biophysical Chemistry Volume: 296 Pages: 106991-106991
  • DOI: 10.1016/j.bpc.2023.106991
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Total Internal Reflection Raman Spectra of Alamethicin Interacting with Supported Lipid Bilayers at a Silica/Water Interface (2022)
  • Author(s): Masato Kondoh, Arisa Sano, Izuru Kawamura, Taka-aki Ishibashi*
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 126 Issue: 50 Pages: 10712-10720
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c06371
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Using cellulose nanofibers isolated from waste hop stems to stabilize dodecane or olive oil-in-water Pickering emulsions (2022)
  • Author(s): Kanai Noriko、Sakai Takahiro、Yamada Kohei、Kumagai Sari、Kawamura Izuru
  • Journal Title: Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects Volume: 653 Pages: 129956-129956
  • DOI: 10.1016/j.colsurfa.2022.129956
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluorescent hydrogel based on self-assembling acridonylalanine-phenylalanine (2022)
  • Author(s): Yuzuha Araki, Hiroki Shirakata, Tetsuya Nakagawa, Takashi Ubukata, Yasushi Yokoyama, Izuru Kawamura
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: - Issue: 7 Pages: 687-689
  • DOI: 10.1246/cl.220170
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 固体NMRによる膜結合ペプチドの構造解析 (2022)
  • Author(s): 川村出
  • Journal Title: ペプチドニュースレタージャパン PNJ Volume: 124 Pages: 8-11
• [Presentation] 微細加工技術を基盤とした人工細胞膜システムの構築 (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 第89回酵素工学研究会
  • Invited
• [Presentation] 細胞膜を人工的に造る：バイオセンシングから分子ロボットまで (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 関東高分子若手研究会
  • Invited
• [Presentation] ナノポアで一分子を「観る」 (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 第9回細胞生物若手の会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] ナノポアを用いたペプチド断片計測とプロテオームへの応用 (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2023
  • Invited
• [Presentation] Artificial cell-membranes: from construction to nanopore applications (2023)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: Institute for Protein Research & iCeMS Joint Seminar
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ナノポアによるDNA演算の電気的デコーディング (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 分子モーター討論会
  • Invited
• [Presentation] De nove design of peptide nanopore (2023)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: Black Forest Nanopore Meeting 2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 脂質膜にナノポアを形成するペプチドの設計とタンパクシーケンスへの応用 (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 第42回ケムステVシンポ
  • Invited
• [Presentation] 固体NMRの基礎分野と廃棄物由来セルロースナノファイバー (2023)
  • Author(s): 川村 出
  • Organizer: 第34回食品ハイドロコロイド研究会
  • Invited
• [Presentation] 固体NMRの基礎 (2023)
  • Author(s): 川村 出
  • Organizer: 第35回高分子学会NMR講座
  • Invited
• [Presentation] Characterization of retinal protonated Schiff base in microbial rhodopsin by solid-state NMR (2023)
  • Author(s): 川村 出
  • Organizer: 第62回NMR討論会(進歩賞受賞招待講演)
  • Invited
• [Presentation] 固体NMRおよびVCDを用いた生体高分子の構造解析 (2023)
  • Author(s): 川村 出
  • Organizer: 北里大学第7回理学部セミナー
  • Invited
• [Presentation] Solid-state NMR on Membrane Proteins and Membrane-bound Peptides (2023)
  • Author(s): Izuru Kawamura
  • Organizer: Institute for Protein Research & iCeMS Joint Seminar
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Solid-state NMR Study of Microbial Rhodopsin in Lipid Environment (2023)
  • Author(s): Izuru Kawamura
  • Organizer: The 10th Asia-Pacific NMR Symposium (APNMR2023)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] バイオナノポアを用いた核酸・ペプチド断片の単分子計測 (2023)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: ATIバイオ単分子研究会
  • Invited
• [Presentation] 細胞膜分子システムにおける膜タンパク質・ペプチドの固体NMR構造解析 (2023)
  • Author(s): 川村出
  • Organizer: 分子サイバネ/超越分子システム合同ワークショップ
  • Invited
• [Presentation] De novo design of nanopores reconstituted in bilayer lipid membrane (2022)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: CEMS Topical Meeting Online
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Artificial cell-membrane system: the construction of de novo nanopores (2022)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: 第60回 日本生物物理学会年会・共催シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Artificial cell-membrane: Construction of peptide nanopores with de novo design (2022)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: International Materials Research Congress 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Bottom-up construction of de novo designed nanopore using peptides (2022)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: Nano Korea 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] De novo 設計ナノポアによる一分子計測と分子ロボット工学への応用 (2022)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] Solid-state NMR spectroscopic approaches to investigate membrane-bound peptide structure (2022)
  • Author(s): Izuru Kawamura
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Solid-state NMR of Krokinobacter rhodopsin 2 and heliorhodopsin (2022)
  • Author(s): Izuru Kawamura
  • Organizer: 19th International Conference on Retinal Proteins
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Bottom-up construction of nanopore with de novo designed peptides (2022)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: AIST-KU Joint Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] De novo design of nanopore using transmembrane peptides (2021)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: 第59回 日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Structure of a sodium ion pump rhodopsin as studied by solid-state NMR (2021)
  • Author(s): Izuru Kawamura
  • Organizer: Pacifichem
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] 低分子ゲル・超分子ゲルの設計開発と応用 (2023)
  • Author(s): 鈴木正浩
  • Total Pages: 234
  • Publisher: シーエムシー出版
  • ISBN: 9784781317496
• [Book] Molecular Robotics An Introduction (2022)
  • Author(s): Satoshi Murata
  • Total Pages: 296
  • Publisher: Springer Nature
  • ISBN: 9789811939877
• [Book] Cell-Penetrating Peptides: Design, Development and Applications (2022)
  • Author(s): Makoto Oba, Yosuke Demizu
  • Total Pages: 416
  • Publisher: Wiley&Sons
  • ISBN: 9783527350117
• [Remarks] 東京農工大学 川野研究室
  • URL: https://web.tuat.ac.jp/~rjkawano/index.html
• [Remarks] 東京農工大学 川野研究室
  • URL: http://web.tuat.ac.jp/~rjkawano/index.html
• [Remarks] 学術変革領域研究A 「超越分子システム」
  • URL: https://bottomup-biotech.elsi.jp/
• [Remarks] 横浜国立大学 川村研究室
  • URL: http://www.ikawamura.ynu.ac.jp/
• [Remarks] 東京農工大学 川野研究室
  • URL: http://web.tuat.ac.jp/~rjkawano/index.html
• [Remarks] 超越分子システムHP
  • URL: https://bottomup-biotech.elsi.jp/
• [Patent(Industrial Property Rights)] リポソームの作製方法及びリポソーム (2023)
  • Inventor(s): 川野竜司、Ji Jiajue
  • Industrial Property Rights Holder: 東京農工大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2023-177885
  • Filing Date: 2023
• [Funded Workshop] 超越分子セミナー（2024年、2月回） (2024)
• [Funded Workshop] 超越分子セミナー（2023年、7月回） (2023)