Cross-scale in-cell cryo-electron tomography and its application to epithelium

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 21H05248
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 吉川 雅英 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (80272425)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥163,540,000 (Direct Cost: ¥125,800,000、Indirect Cost: ¥37,740,000); Fiscal Year 2025: ¥28,470,000 (Direct Cost: ¥21,900,000、Indirect Cost: ¥6,570,000); Fiscal Year 2024: ¥28,990,000 (Direct Cost: ¥22,300,000、Indirect Cost: ¥6,690,000); Fiscal Year 2023: ¥28,340,000 (Direct Cost: ¥21,800,000、Indirect Cost: ¥6,540,000); Fiscal Year 2022: ¥29,120,000 (Direct Cost: ¥22,400,000、Indirect Cost: ¥6,720,000); Fiscal Year 2021: ¥48,620,000 (Direct Cost: ¥37,400,000、Indirect Cost: ¥11,220,000)
• Keywords: クライオ電子線トモグラフィー / Cryo-FIB-SEM / 形状標識 / CLEM / FIB-SEM / 上皮 / 繊毛 / 標識

Outline of Research at the Start

本領域の推進する「クロススケール細胞計測センター」の中で、我々のグループはクライオ電子線トモグラフィー（Cryo-ET）を、他の班の技術と統合することにより、細胞内のメゾ複雑体を含むクロススケール計測を可能とする技術開発を行う。これによって、メゾ複雑体の初期状態→遷移状態→最終状態のスナップショットを高解像度で可視化して、細胞内におけるタンパク質分子の分布・構造・状態を解明できると考える。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、クライオ電子線トモグラフィーを用い上皮細胞の形態形成のメカニズムを分子レベルから解明する。上皮細胞は、外界と臓器の「インターフェー ス」に当たり、臓器の機能に応じて様々な形態を取る。本提案では、これまで我々が研究してきた繊毛に加え、小腸の微絨毛や耳の不動毛など、これまで全く未開拓であった脊椎動物の上皮組織を対象とする。この目的のために、クライオ電子顕微鏡用の新しい細胞内標識「形状ラベル」を開発・応用することで、上皮の 形態形成のメカニズムを解明する。
本年度は、繊毛の構造解析、特にゼブラフィッシュを用いてカルシウムによる繊毛の制御機構、クラミドモナスを用いて中心対微小管の構造を解明した結果を論文として投稿した。前者はeLifeにて出版され、また、後者はrevision中である。ゼブラフィッシュを用いたカルシウムによる影響については、mutantを用いて生理学的な解析を行い、続報として投稿した。この論文も、現在revision中である。また、公募班の小田グループと共同で、膀胱上皮の構造解析と繊毛に於けるチューブリンC末端修飾に関する論文を出版した。計画班の稲葉グループとは、ゴルジ体で働く亜鉛トランスポーターの構造解析の論文を出版した。
さらに上皮に関する構造解析を行うためにFocused-Ion-Beamを用いたラメラの作成技術をハイスループット化したので、それらを用いて2024年度は上皮の構造をクライオ電子線トモグラフィーを用いて高解像度で解析していく予定である。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

概要・実績にあるように、2023年度中に7報の論文を出版できたこと、さらに現在reivision中の論文も数多くある事から、計画以上に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

新たに開発しつつある形状ラベルや、ハイスループット化したFIB-SEMを用いて新たな上皮構造の解明を進める。また、2024年度に加わった公募班とも積極的に共同研究を進め、論文として投稿する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Purdue University(米国)
• [Journal Article] The role of the C-terminal tail region as a plug to regulate XKR8 lipid scramblase (2024)
  • Author(s): Sakuragi Takaharu、Kanai Ryuta、Otani Mayumi、Kikkawa Masahide、Toyoshima Chikashi、Nagata Shigekazu
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 300 Issue: 3 Pages: 105755-105755
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2024.105755
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Calaxin stabilizes the docking of outer arm dyneins onto ciliary doublet microtubule in vertebrates (2023)
  • Author(s): Yamaguchi Hiroshi、Morikawa Motohiro、Kikkawa Masahide
  • Journal Title: eLife Volume: 12
  • DOI: 10.7554/elife.84860
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ATP‐Responsive Nanoparticles Covered with Biomolecular Machine “Chaperonin GroEL” (2023)
  • Author(s): Shen Hao K.、Morishita Kiyoshi、Hashim P. K.、Okuro Kou、Kashiwagi Daiki、Kimura Ayumi、Yanagisawa Haruaki、Kikkawa Masahide、Niwa Tatsuya、Taguchi Hideki、Aida Takuzo
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 62 Issue: 31
  • DOI: 10.1002/anie.202304894
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] α- and β-tubulin C-terminal tails with distinct modifications are crucial for ciliary motility and assembly (2023)
  • Author(s): Kubo Tomohiro、Tani Yuma、Yanagisawa Haru-Aki、Kikkawa Masahide、Oda Toshiyuki
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: 136 Issue: 16
  • DOI: 10.1242/jcs.261070
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM structures of human zinc transporter ZnT7 reveal the mechanism of Zn2+ uptake into the Golgi apparatus (2023)
  • Author(s): Bui Han Ba、Watanabe Satoshi、Nomura Norimichi、Liu Kehong、Uemura Tomoko、Inoue Michio、Tsutsumi Akihisa、Fujita Hiroyuki、Kinoshita Kengo、Kato Yukinari、Iwata So、Kikkawa Masahide、Inaba Kenji
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Issue: 1 Pages: 4770-4770
  • DOI: 10.1038/s41467-023-40521-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A quest to unravel the role of the stalk and microtubule‐binding domain of axonemal dyneins (2023)
  • Author(s): Kikkawa Masahide
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 597 Issue: 17 Pages: 2147-2148
  • DOI: 10.1002/1873-3468.14707
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM elucidates the uroplakin complex structure within liquid-crystalline lipids in the porcine urothelial membrane (2023)
  • Author(s): Yanagisawa Haruaki、Kita Yoshihiro、Oda Toshiyuki、Kikkawa Masahide
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 6 Issue: 1 Pages: 1018-1018
  • DOI: 10.1038/s42003-023-05393-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Calaxin stabilizes the docking of outer arm dyneins onto ciliary doublet microtubule in vertebrates. (2022)
  • Author(s): Yamaguchi, H., Morikawa, M., Kikkawa, M.
  • Journal Title: BioRxiv Volume: NA
  • DOI: 10.1101/2022.11.10.516068
  • Open Access
• [Journal Article] Identifying proteins in the cell by tagging techniques for cryo-electron microscopy (2022)
  • Author(s): Masahide Kikkawa, Haruaki Yanagisawa
  • Journal Title: Microscopy (Oxf) Volume: 71 Issue: Supplement_1 Pages: i60-i65
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfab059
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae (2022)
  • Author(s): Fabian Eisenstein, Haruaki Yanagisawa, Hiroka Kashihara, Masahide Kikkawa, Sachiko Tsukita, adostin Danev
  • Journal Title: bioRxiv Volume: 0 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1101/2022.04.07.487557
• [Presentation] 第8回日本骨免疫学会 冬期学術集会 (2024)
  • Author(s): 吉川 雅英
  • Organizer: クライオ電子顕微鏡によるクロススケール観察
  • Invited
• [Presentation] JST主催 第2回タンパク質シンポジウム プログラム (2024)
  • Author(s): 吉川 雅英
  • Organizer: クライオ電子顕微鏡による上皮構造のクロススケール観察
• [Presentation] 第129回日本解剖学会総会・全国学術集会 (2024)
  • Author(s): 牧野 司
  • Organizer: 精子形成におけるマンシェット輸送をになう新たなキネシンモーターの分子機構
• [Presentation] 日本顕微鏡学会第79回学術講演会 (2023)
  • Author(s): 吉川 雅英
  • Organizer: クライオ電子顕微鏡による細胞骨格・モーター分子への応用
  • Invited
• [Presentation] 日本顕微鏡学会第79回学術講演会 (2023)
  • Author(s): 齊藤 知恵子
  • Organizer: 広域三次元光ー電子相関電子顕微鏡法で紐解く細胞内分解ダイナミクス
• [Presentation] 日本顕微鏡学会第79回学術講演会 (2023)
  • Author(s): 楊 景霏
  • Organizer: The introduction and structural analysis with cryo-EM of M13 bacteriophage
• [Presentation] 日本顕微鏡学会第79回学術講演会 (2023)
  • Author(s): 佐々木 諒平
  • Organizer: クライオ電子顕微鏡による微小管-ダイナミン複合体構造解析
• [Presentation] 第49回内藤コンファレンス (2023)
  • Author(s): 吉川 雅英
  • Organizer: Combination of cryo-EM and genetics for studying microtubule-binding proteins
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 第49回内藤コンファレンス (2023)
  • Author(s): 谷 侑磨
  • Organizer: FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas flagella
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 第49回内藤コンファレンス (2023)
  • Author(s): 安 建成
  • Organizer: GAS2 mediates F-actin and microtubule crosslinking
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 第49回内藤コンファレンス (2023)
  • Author(s): 牧野 司
  • Organizer: Analysis of a Novel Kinesin Motor Involved in Sperm specific Manchette-Transport
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 第49回内藤コンファレンス (2023)
  • Author(s): 山口 博史
  • Organizer: Cryo-electron tomography revealed that Calaxin stabilizes the docking of outer arm dyneins onto ciliary doublet microtubule in vertebrates
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 第23回日本蛋白質科学会年会 (2023)
  • Author(s): 佐々木 諒平
  • Organizer: Prevention of particle adsorption at the air/water interface using DNA support structures for cryo-EM.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 学術変革領域会議 (2023)
  • Author(s): 吉川 雅英
  • Organizer: Combination of genetics and cryo-electron tomography to study various epitheliums
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 学術変革領域会議 (2023)
  • Author(s): 牧野 司
  • Organizer: KIF6 Gene Deletion Causes Sperm Flagellar Immobility: Insights from KIF6 KO Mice
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 学術変革領域会議 (2023)
  • Author(s): 山口 博史
  • Organizer: Cryo-electron tomography for structural/functional analysis of vertebrate ciliary axoneme
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 学術変革領域会議 (2023)
  • Author(s): 谷 侑磨
  • Organizer: FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas flagella
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] IMC20(The 20th International Microscopy Congress) (2023)
  • Author(s): 吉川 雅英
  • Organizer: Combination of genetics and cryo-electron tomography to study the docking of outer arm dyneins onto ciliary doublet microtubule in vertebrates
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Complete structure of M13 phage by cryo-electron microscopy. (2023)
  • Author(s): Masahide Kikkawa
  • Organizer: 第7回日本骨免疫学会 冬期学術集会
  • Invited
• [Presentation] Bioconjugation of Au25 nanocluster to trastuzumab. (2023)
  • Author(s): Katarzyna Malawska
  • Organizer: The 103rd CSJ Annual Meeting (2023)
• [Presentation] Combination of cryo-electron tomography and genetics to study cilia/flagella (2023)
  • Author(s): Masahide Kikkawa
  • Organizer: Cold Spring Harbor Conference Asia: Cilia and Centrosome
  • Invited
• [Presentation] Cryo-electron tomography revealed that Calaxin stabilizes the docking of outer arm dyneins onto ciliary doublet microtubule in vertebrates (2023)
  • Author(s): Hiroshi Yamaguchi
  • Organizer: Cold Spring Harbor Conference Asia: Cilia and Centrosome
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas (2023)
  • Author(s): Yuma Tani
  • Organizer: Cold Spring Harbor Conference Asia: Cilia and Centrosome
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] GAS2 mediates F-actin and microtubule crosslinking (2023)
  • Author(s): Jiancheng An
  • Organizer: Cold Spring Harbor Conference Asia: Cilia and Centrosome
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 精子形成におけるマンシェット輸送をになう新たなキネシンモーターの解析 (2023)
  • Author(s): 牧野司
  • Organizer: 第128回 日本解剖学会総会・全国学術総会
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡を用いた繊毛軸糸ダイニンコンポーネントCalaxinの機能解析 (2022)
  • Author(s): 山口 博史
  • Organizer: 第74回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] Cryo-electron tomography revealed that Calaxin stabilizes the docking of outer arm dyneins onto ciliary doublet microtubule in vertebrate (クライオ電子顕微鏡を用いた繊毛軸糸ダイニンコンポーネント Calaxin の機能解析) (2022)
  • Author(s): Hiroshi Yamaguchi
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas (2022)
  • Author(s): Yuma Tani
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Near-atomic cryo-EM structure of GAR domain bound to the microtuble (2022)
  • Author(s): Jiancheng An
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas (2022)
  • Author(s): Yuma Tani
  • Organizer: 日本顕微鏡学会若手研究部会2022年度シンポジウム
• [Presentation] クライオ電子線トモグラフィーとcryo-FIB-SEMによる上皮構造の観察 (2022)
  • Author(s): 吉川雅英
  • Organizer: 統合生命科学研究科シンポジウム 分子原子レベルの統合生命科学研究
  • Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡によるクロススケール観察 (2022)
  • Author(s): 吉川雅英
  • Organizer: リサーチトレンド2022 第4回クライオ電子顕微鏡ワークショップ
  • Invited
• [Presentation] The introduction and structural analysis with cryo-EM of M13 Bacteriophage (2022)
  • Author(s): Jingfei Yang
  • Organizer: 日本顕微鏡学会若手研究部会2022年度シンポジウム
• [Presentation] Prevention of particle denaturation on the air/water interface with the aid of DNA support structure for cryo-electron microscope. (2022)
  • Author(s): Ryohei Sasaki
  • Organizer: 日本顕微鏡学会若手研究部会2022年度シンポジウム
• [Presentation] cryo-ET を用いた繊毛軸糸ダイニンコンポーネント Calaxin の機能解析 (2022)
  • Author(s): 山口 博史
  • Organizer: 第12回繊毛研究会
• [Presentation] FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas (2022)
  • Author(s): Yuma Tani
  • Organizer: 第12回繊毛研究会
• [Presentation] FAP47, HYDIN, and CPC1 in the central pair apparatus of Chlamydomonas (2022)
  • Author(s): Yuma Tani
  • Organizer: Cell Bio 2022 An ASCB | EMBO Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Ultrastructural Analysis of Isolation Membrane by Cryo-Electron Tomography and Cryo-Focused Ion Beam (2022)
  • Author(s): Yoshiyuki Fukuda
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第78回学術講演会
• [Presentation] Morphological analysis of the isolation membrane by cryo-electron tomography and cryo-FIB (2022)
  • Author(s): Yoshiyuki Fukuda
  • Organizer: The 10th International Symposium on Autophagy
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Ultrastructural Analysis of Isolation Membrane by Cryo-Electron Tomography and Cryo-Focused Ion Beam (2022)
  • Author(s): Yoshiyuki Fukuda
  • Organizer: 日本顕微鏡学会若手研究部会2022年度シンポジウム
• [Presentation] Morphological analysis of the isolation membrane by cryo-electron tomography and cryo-focused ion beam (2022)
  • Author(s): Yoshiyuki Fukuda
  • Organizer: The 4th East-Asia Microscopy Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] クライオ電顕トモグラフィーによる脊椎動物の軸糸ダイニンリンカー構造の解析 (2021)
  • Author(s): Hiroshi Yamaguchi
  • Organizer: 顕微鏡学会
• [Presentation] Combination of cryo-EM and genetics to study epithelial cells (2021)
  • Author(s): Masahide Kikkawa
  • Organizer: Korean Society for Molecular and Cellular Biology 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Combination of cryo-EM ang genetics to study cilia/flagella (2021)
  • Author(s): Masahide Kikkawa
  • Organizer: Computer simulations and Cryo-ET/EM of complex biomolecular systems
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡によるクロススケール観察 (2021)
  • Author(s): 吉川雅英
  • Organizer: 第6回 日本骨免疫学会 ウィンタースクール
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cryo electron tomography of cellular specimens (2021)
  • Author(s): Yoshiyuki Fukuda
  • Organizer: KSBMB International Conference 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 東京大学・大学院・医学系研究科・生体構造学分野 ホームページ
  • URL: https://structure.m.u-tokyo.ac.jp