細胞内分子構造動態を解明するためのクロススケールIn-cell NMR解析

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 21H05250
• Research Category: Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Transformative Research Areas, Section (III)
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 西田 紀貴 千葉大学, 大学院薬学研究院, 教授 (50456183)
• Project Period (FY): 2021-09-10 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥91,780,000 (Direct Cost: ¥70,600,000、Indirect Cost: ¥21,180,000); Fiscal Year 2025: ¥16,770,000 (Direct Cost: ¥12,900,000、Indirect Cost: ¥3,870,000); Fiscal Year 2024: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2023: ¥16,640,000 (Direct Cost: ¥12,800,000、Indirect Cost: ¥3,840,000); Fiscal Year 2022: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000); Fiscal Year 2021: ¥24,310,000 (Direct Cost: ¥18,700,000、Indirect Cost: ¥5,610,000)
• Keywords: in-cell NMR / 動的構造平衡 / メゾ複雑体 / 液液相分離 / バイオリアクター / HDM2 / In-cell NMR / KRAS / 動的構造 / Ras / Rac1 / KO細胞

Outline of Research at the Start

本研究では、これまでに我々が開発を進めてきたIn-cell NMR技術をさらに発展させ、細胞内タンパク質の構造ダイナミクス、細胞内制御因子との相互作用、細胞内局所環境における観測を可能とする新たなIn-cell NMR技術を開発する。開発した手法を領域内の他の計画班や公募班とも連携し、さまざまな細胞内メゾ複雑体の動的構造・相互作用解析へと適用することで、これらの構造体が関わる生命現象や疾患の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

①細胞内構造ダイナミクスの観測：E3ユビキチンリガーゼであるHDM2のp53結合ドメインの動的構造解析を行った。これまでの研究からHDM2はp53結合部位が露出したopen状態と、N末端のフレキシブルなlidがp53結合部位を塞ぐように結合したclosed状態の2状態平衡にあると考えられてきたが、我々のNMR解析からHDM2はclosed状態内にfast exchange regimeの交換を含むmulti-stateな構造平衡にあることを見出した。また、分子動力学シミュレーションによりNMR観測結果と合致する2つのclosed状態の構造を可視化することにも成功した。
②特定の細胞内局所環境の影響を解明する技術：大腸菌ペリプラズム空間内に局在化したメタロβラクタマーゼ（MBL）を対象としたin-cell NMR観測を試みた。まず、N末端のシグナル配列を検討し、MalE配列が最も高効率にペリプラズム空間への発現を誘導することを見出した。さらに発現誘導時に5－フルオロインドールを培地に添加することで、MDL-1のTrp残基のin-cell NMRシグナルを観測することができた。またMDL-1の阻害剤であるミリセチン添加により相互作用に伴う化学シフト変化の観測にも成功した。
③細胞内メゾ複雑体の構造解析：低温条件下でのαシヌクレインのin-cell NMR観測を行うため、低温条件でもゲル状態を保持可能なアルギン酸ビーズに細胞を封入して、バイオリアクター潅流下でのin-cell NMR観測を行った。その結果、20時間にわたってαSYNのin-cell NMRシグナルを観測できることが示された。
SARS-Cov2由来ORF6は核膜孔タンパク質を介した細胞内輸送を阻害する。ORF6のサイズ排除クロマトグラフィーとNMR解析を行い、オリゴマーを形成したORFの一部が溶液中ではフレキシブルな構造をとっていることを明らかにした。この領域を介してORF6オリゴマーが核膜タンパク質Rae1と相互作用に寄与している可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は昨年度に引き続きIn-cell NMR観測法の技術開発を行い、①NMRと分子動力学計算を組み合わせた動的構造平衡の解析法の開発、②19Fプローブを利用して大腸菌ペリプラズム空間に局在化したタンパク質のin-cell NMRシグナルの観測に成功するなど、一定の成果を挙げることができた。加えて細胞内メゾ複雑体を観測対象としたIn-cell NMR観測にも着手し、細胞内におけるαSYNのNMRシグナルを長時間にわたって観測する手法を確立できたことから、研究は概ね順調に進展していると判断している。

Strategy for Future Research Activity

細胞内構造ダイナミクスの解析については、新たにE3ユビキチンリガーゼHDM2の動的構造にリン酸化や分子混雑環境が与える影響をNMRと分子動力学シミュレーションの両面から解析を行う。また、19FをプローブとしたIn-cell NMR観測については、細胞膜に局在化したKRASにも対象を広げる。αSYNについては今年度に確立した低温条件下でのIn-cell NMR法を野生型や様々な病原性変異体に適用し、モノマー間の相互作用や線維形成に由来するNMRシグナル変化の観測を試みる。さらに領域内の共同研究を進め、NMR法による動的構造情報に基づいてメゾ複雑体の構造・機能解明に貢献する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] トロント大学(カナダ)
• [Int'l Joint Research] Unversity of Toronto(カナダ)
• [Int'l Joint Research] トロント大学(カナダ)
• [Journal Article] Deciphering the Multi-state Conformational Equilibrium of HDM2 in the Regulation of p53 Binding: Perspectives from Molecular Dynamics Simulation and NMR Analysis (2024)
  • Author(s): Kazuki Watanabe, Qingci Zhao, Ryosuke Iwatsuki, Ryota Fukui, Weitong Ren, Yuji Sugita, and Noritaka Nishida
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 146 Issue: 14 Pages: 9790-9800
  • DOI: 10.1021/jacs.3c14383
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Real-Time Monitoring of RAS Activity Using In Vitro and In-Cell NMR Spectroscopy (2024)
  • Author(s): Zhao Qingci、Shimada Ichio、Nishida Noritaka
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2797 Pages: 237-252
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-3822-4_17
  • ISBN: 9781071638217, 9781071638224
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nanoscopic Elucidation of Spontaneous Self-Assembly of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Open Reading Frame 6 (ORF6) Protein (2023)
  • Author(s): Nishide Goro、Lim Keesiang、Tamura Maiki、Kobayashi Akiko、Zhao Qingci、Hazawa Masaharu、Ando Toshio、Nishida Noritaka、Wong Richard W.
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry Letters Volume: 14 Issue: 38 Pages: 8385-8396
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.3c01440
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Real-time monitoring of the reaction of KRAS G12C mutant specific covalent inhibitor by in vitro and in-cell NMR spectroscopy (2023)
  • Author(s): Zhao Qingci、Haga Ryoka、Tamura Satoko、Shimada Ichio、Nishida Noritaka
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 13 Issue: 1 Pages: 19253-19253
  • DOI: 10.1038/s41598-023-46623-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] RAC1発がん性変異体の動的分子機構 (2023)
  • Author(s): 外山侑樹、西田紀貴、嶋田一夫
  • Journal Title: 月刊「細胞」 Volume: 55 Pages: 136-139
• [Journal Article] In-cell NMR法を用いた細胞内生命現象のリアルタイム観測 (2022)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Journal Title: 日本核磁気共鳴学会機関紙 Volume: 12 Pages: 17-22
• [Journal Article] Analysis of Binding Modes of Antigen-Antibody Complexes by Molecular Mechanics Calculation (2021)
  • Author(s): Qu Liang、Qiao Xinyue、Qi Fei、Nishida Noritaka、Hoshino Tyuji
  • Journal Title: Journal of Chemical Information and Modeling Volume: 61 Issue: 5 Pages: 2396-2406
  • DOI: 10.1021/acs.jcim.1c00167
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantifying the Separation of Positive and Negative Areas in Electrostatic Potential for Predicting Feasibility of Ammonium Sulfate for Protein Crystallization (2021)
  • Author(s): Guo Yan、Nishida Noritaka、Hoshino Tyuji
  • Journal Title: Journal of Chemical Information and Modeling Volume: 61 Issue: 9 Pages: 4571-4581
  • DOI: 10.1021/acs.jcim.1c00505
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 分子夾雑系が変調する細胞内タンパク質の構造と機能 (2021)
  • Author(s): 趙 慶慈、嶋田 一夫、西田 紀貴
  • Journal Title: 月刊細胞 Volume: 53 Pages: 352-355
• [Journal Article] バイオリアクター型in-cell NMR法の開発とRasの活性状態の観測への応用 (2021)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Journal Title: 生化学 Volume: 93 Pages: 819-823
  • NAID: 40022783951
• [Presentation] In-cell NMR observation of protein conformational and functional modulation under intracellular condition (2023)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第23回蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] Intracellular modulation of GTP-bound level of RAS as revealed by in-cell NMR (2023)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: ISMAR2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] in-cell NMR法を用いた細胞内生命現象のリアルタイム観測 (2023)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第23回若手NMR研究会
  • Invited
• [Presentation] In-cell NMR Observation of Liquid-Liquid Phase Separation of FUS (2023)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] Intracellular quantification of the activity of RAS signaling regulators by in-cell NMR with genome editing technique (2023)
  • Author(s): 趙慶慈, 増田豪, 嶋田一夫,西田紀貴
  • Organizer: クロススケール新生物学 第3回領域会議
• [Presentation] in-cell NMR observation of the liquid-liquid phase separation (LLPS) prone protein (2023)
  • Author(s): 田村真生, 趙慶慈,西田紀貴
  • Organizer: クロススケール新生物学 第3回領域会議
• [Presentation] Exploring the conformational dynamics of the disordered Lid region of HDM2 N-terminal domain with MD simulation (2023)
  • Author(s): 渡邉一樹, Weitong Ren, 趙慶慈, 杉田有治, 西田紀貴
  • Organizer: クロススケール新生物学 第3回領域会議
• [Presentation] Elucidation of the multi-state conformational equilibrium of HDM2 involved in the regulation of p53 tumor suppressor. (2023)
  • Author(s): 岩月亮介，渡邉一樹, 福井涼太, Weitong Ren, 趙慶慈, 杉田有治, 西田紀貴
  • Organizer: 第62回 NMR討論会
• [Presentation] Elucidation of the structural dynamics underlying the intracellular regulatory mechanism of Rac1 activation state by in-cell NMR analysis (2023)
  • Author(s): 小林航、趙慶慈、道内克宗、外山祐樹、上田卓見、竹内恒、嶋田一夫、西田紀貴
  • Organizer: 第62回 NMR討論会
• [Presentation] In-cell NMR法を用いた 細胞内タンパク質のクロススケール観測 (2023)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第128回日本解剖学会総会
  • Invited
• [Presentation] EXPLORING THE CONFORMATIONAL DYNAMICS OF THE DISORDERED LID REGION OF HDM2 N-TERMINAL DOMAIN WITH MOLECULAR DYNAMICS SIMULATION. (2023)
  • Author(s): Kazuki Watanabe, Weitong Ren, Qingci Zhao, Ryosuke Iwatsuki, Noritaka Nishida, Yuji Sugita
  • Organizer: BPS 2023 67th Biophysical Society Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞内タンパク質の分子動態を解明するためのクロススケールIn-cell NMR解析 (2022)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第1回生命金属科学シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] In-cell NMR 観測による細胞内タンパク質の活性制御機構の解明 (2022)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第22回蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] ゲノム編集法とin-cell NMR法の融合によるRAS制御因子の細胞内活性の定量 (2022)
  • Author(s): 趙慶慈、嶋田一夫、西田紀貴
  • Organizer: 第22回蛋白質科学会
  • Invited
• [Presentation] Intracellular Modulation of GTP-bound Levels of Ras as revealed by in-cell NMR (2022)
  • Author(s): Qingci Zhao, Ryu Fujimiya, Satoshi Kubo, Christopher B Marshall, Mitsuhiko Ikura, Ichio Shimada, Noritaka Nishida
  • Organizer: ICMRBS2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Elucidation of the structural dynamics underlying the intracellular regulatory mechanism of Rac1 activation state by in-cell NMR analysis (2022)
  • Author(s): 小林航、趙慶慈、道内克宗、外山祐樹、上田卓見、竹内恒、嶋田一夫、西田紀貴
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 分子夾雑環境が変調するタンパク質の構造と機能 (2021)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: 第21回蛋白質科学会
  • Invited
• [Presentation] 細胞内生命現象をリアルタイム観測するNMR法の開発と応用 (2021)
  • Author(s): 西田紀貴
  • Organizer: ISMAR-APNMR-NMRSJ-SEST2021
  • Invited
• [Presentation] Observation of Conformational Equilibrium of Intracellular Rac1 by In-cell NMR (2021)
  • Author(s): Katsuhiro Donai, Qingci Zhao, Yuki Toyama, Ichio Shimada, Noritaka Nishida
  • Organizer: ISMAR-APNMR-NMRSJ-SEST2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] FMO計算によるSARS-CoV-2変異株RBD-中和抗体間の相互作用解析 (2021)
  • Author(s): 渡邉一樹、 渡邉千鶴、 本間光貴、 田雨時 、 川嶋裕介、 川下理日人、 星野忠次、 西田紀貴1、 福澤薫、 高木達也
  • Organizer: 第65回日本薬学会関東支部大会
• [Presentation] ヘパリンリアーゼ組み換えタンパク質の精製と基質特異性の解析 (2021)
  • Author(s): 田中健太郎、 西村和洋、 星野忠次、 西田紀貴、 戸井田敏彦
  • Organizer: 第65回日本薬学会関東支部大会
• [Presentation] 創薬スクリーニングの標的となる Ras変異体の探索 (2021)
  • Author(s): 前嶋乃理絵、 趙慶慈、 芳賀涼花、 星野忠次、 西田紀貴
  • Organizer: 第65回日本薬学会関東支部大会
• [Remarks] 千葉大学薬学部 薬品物理化学研究室ホームページ
  • URL: https://www.p.chiba-u.jp/lab/bukka/index.html
• [Remarks] 千葉大学薬学研究院薬品物理化学研究室ホームページ
  • URL: https://www.p.chiba-u.jp/lab/bukka/index.html