免疫神経インターフェースにおけるシグナル授受の構造的基盤

• Project Area: Analysis and synthesis of multi-dimensional immune organ network
• Project/Area Number: 24111006
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高木 淳一 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (90212000)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北郷 悠 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (60507185)
• Project Fiscal Year: 2012-06-28 – 2017-03-31
• Project Status: Granted(Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥146,770,000 (Direct Cost : ¥112,900,000、Indirect Cost : ¥33,870,000); Fiscal Year 2016 : ¥28,080,000 (Direct Cost : ¥21,600,000、Indirect Cost : ¥6,480,000); Fiscal Year 2015 : ¥28,080,000 (Direct Cost : ¥21,600,000、Indirect Cost : ¥6,480,000); Fiscal Year 2014 : ¥28,210,000 (Direct Cost : ¥21,700,000、Indirect Cost : ¥6,510,000); Fiscal Year 2013 : ¥28,080,000 (Direct Cost : ¥21,600,000、Indirect Cost : ¥6,480,000); Fiscal Year 2012 : ¥34,320,000 (Direct Cost : ¥26,400,000、Indirect Cost : ¥7,920,000)
• Keywords: 免疫-神経インターフェイス / X線結晶構造解析 / 電子顕微鏡イメージング / インテグリン / セマフォリン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、Ｘ線結晶構造解析と電子顕微鏡イメージングという分解能の異なる手法を併用し、免疫-神経インターフェースの素反応を司る分子実体の構造生物学的解明を目指している。主なターゲットとして、（１）インテグリンを中心とした接着受容体の解析と、（２）セマフォリン(Sema)･プレキシン(Plexin)系を中心とした細胞間シグナル授受メカニズムの解析、（３）神経細胞やニッチ細胞の恒常性維持に働く蛋白質の構造機能解析、を行った。
研究1（インテグリン受容体系）：α6β1インテグリンについては、構造安定性に関するこれまでの検討結果を元にデザインした組み換え蛋白質を大量に精製して結晶化を開始した。また、リガンドであるラミニン断片の結晶化に成功した。α5β1インテグリンについては脂質二重膜（ナノディスク）に組み込み、ネガティブ染色による電子顕微鏡を用いて一分子イメージングに成功した。
研究２（セマフォリンシグナル系）：Sema3A受容体のPlexin A1について、企業との共同研究によってアゴニスト活性をもつ抗体の取得に成功し、そのエピトープ同定および複合体の電顕イメージングも達成した。また、Sema4Dシグナルを阻害する環状ペプチドとPlexin B1の複合体の2.8Åでの構造決定に成功した。さらに、神経系および免疫系で働くSema3Aについて、マウスとヒト両方の蛋白質を認識する活性阻害抗体の開発にも成功した。
研究３（神経､ニッチ細胞系）：ニューロン特異的受容体蛋白質sorLAについて、それがアミロイドペプチドを結合している状態で複合体の結晶構造解析に成功し、その成果が論文になるとともに各種メディアにも取り上げられた。また、ニッチ細胞から産生され幹細胞の維持や分化に必須なWnt蛋白質について、活性を保ったままの精製に成功した。　

Current Status of Research Progress

Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究１において、α6β1インテグリン自身の結晶化に先駆けて、リガンドであるラミニンの結晶化を達成し、世界初の構造決定がH27年度中には達成できる見込みである。α5β1インテグリンについてもナノディスクへの組み込みと電顕イメージングに成功し、β1インテグリンの「膜上での構造」を明らかにすることができた。研究２については様々な免疫関連疾患の治療法開発に役立つ抗体（プレキシンA1のアゴニスト抗体、Sema3aの阻害抗体など）の開発が進み、骨粗鬆症薬のリードとなる可能性があるペプチドがターゲットであるプレキシンB1に結合している状態の構造解析を達成するなど、予想を上回る成果が上がってきている。さらに研究３においては、上記のようにアルツハイマー病の新規予防法開発にもつながり得る成果を挙げ、新聞、テレビなど各種メディアに紹介された。それに加え、幹細胞からの様々な細胞分化誘導に必須なWnt蛋白質の安定な生産を可能にする発見があり（論文執筆中）、特許出願も済ませた。よって総合的には「①当初の計画以上に進展している」と自己評価する。

Research Output

• [Journal Article] 電子顕微鏡技術の進展と相関解析 (2015)
  • Author(s): 岩崎憲治
  • Journal Title: 日本結晶学会誌 Volume : Vol57, No1 Pages : 66-71
• [Journal Article] 巨大受容体sorLAによるアミロイドβ分解の促進 (2015)
  • Author(s): 北郷 悠、高木 淳一
  • Journal Title: 医学のあゆみ(医歯薬出版) Volume : vol.252(9) Pages : 963-964
• [Journal Article] Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. (2015)
  • Author(s): Kitago Y, Nagae M, Nakata Z, Yagi-Utsumi M, Takagi-Niidome S, Mihara E, Nogi T, Kato K, Takagi J.
  • Journal Title: Nat Struct Mol Biol. Volume : 22 Pages : 199-206
  • DOI: 10.1038/nsmb.2954.
• [Journal Article] A structure-based model of substrate discrimination by a non-canonical PDZ tandem in the intramembrane-cleaving protease RseP. (2014)
  • Author(s): Hizukuri Y, T, Tabata S, Tamura-Kawakami K, Oda T, Sato M, Takagi J, Akiyama Y, and Nogi T.
  • Journal Title: Structure Volume : 22 Pages : 326ー336
  • DOI: 10.1016/j.str.2013.12.003.
• [Journal Article] Novel role for SORLA/SORL1 as lysosomal sorting receptor for amyloid-b peptide is impaired by familial Alzheimer disease mutation. (2014)
  • Author(s): Caglayan S, Takagi-Niidome S, Liao F, Carlo A-S, Schmidt V, Burgert T, Kitago Y, Füchtbauer E-M, Füchtbauer A, Holtzman DM, Takagi J, and Wilnow TE.
  • Journal Title: Science Transl. Med. Volume : 6 Pages : 223ra20ー
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.3007747
• [Journal Article] PA tag: a versatile protein tagging system using a super high affinity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin. (2014)
  • Author(s): Fujii, Y., Kaneko, M., Neyazaki, M., Nogi, T., Kato, Y. and Takagi, J.
  • Journal Title: Protein Exp. Purif. Volume : 95 Pages : 240ー247
  • DOI: 10.1016/j.pep.2014.01.009.
• [Journal Article] ここまで進んだ3-D電顕 (2014)
  • Author(s): 岩崎憲治,宮崎直幸
  • Journal Title: メディカル・ダイジェスト，ニューサイエンス, Volume : Vol40, No.9. Pages : 5-6
• [Journal Article] 超高親和性を有する新規アフィニティータグシステム”PAタグシステム” (2014)
  • Author(s): 藤井勇樹，金子美華，加藤幸成，高木淳一
  • Journal Title: 和光純薬時報 Volume : 82, 4. Pages : 2-4
• [Journal Article] Editorial overview: New constructs and expression of proteins: Making things better. (2014)
  • Author(s): Takagi, J. and Tate, CG.
  • Journal Title: Curr Opin Struct Biol. Volume : 26 Pages : iv-iv.
  • DOI: 10.1016/j.sbi.2014.05.001.
• [Journal Article] Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Enpp6. (2014)
  • Author(s): Morita J, Kato K, Mihara E, Ishitani R, Takagi J, Nishimasu H, Aoki J, and Nureki O.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. Volume : 70 Pages : 794-799
  • DOI: 10.1107/S2053230X14008929.
• [Journal Article] Giant cadherins Fat and Dachsous self-bend to organize properly spaced intercellular junctions. (2014)
  • Author(s): Yoshikazu Tsukasaki, Naoyuki Miyazaki, Atsushi Matsumoto, Shigenori Nagae, Shigenobu Yonemura, Takuji Tanoue, Kenji Iwasaki, and Masatoshi Takeichi.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Science USA Volume : 111(45) Pages : 16011-16016
  • DOI: 10.1073 /pnas.1418990111.
• [Journal Article] Crystal structures of carbohydrate recognition domain of blood dendritic cell antigen-2 (BDCA2) reveal a common domain-swapped dimer. (2014)
  • Author(s): Nagae M, Ikeda A, Kitago Y, Matsumoto N, Yamamoto K, Yamaguchi Y.
  • Journal Title: Proteins Volume : 82 Pages : 1512-1518
  • DOI: 10.1002/prot.24504
• [Journal Article] 新規アフィニティータグ“PA タグ”の利用法～蛋白質の精製および検出～ (2014)
  • Author(s): 藤井勇樹, 金子美華, 加藤幸成, 高木淳一
  • Journal Title: 蛋白質科学会アーカイブ Volume : 7 Pages : e075
• [Journal Article] A point mutation in Semaphorin 4A associates with defective endosomal sorting and causes retinal degeneration. (2013)
  • Author(s): Nojima S, Toyofuku T, Kamao H, Ishigami C, Kaneko J, Okuno T, Takamatsu H, Ito D, Kang S, Kimura T, Yoshida Y, Morimoto K, Maeda Y, Ogata A, Ikawa M, Morii E, Aozasa K, Takagi J, Takahashi M, Kumanogoh A.
  • Journal Title: Nature Commun. Volume : 4 Pages : 1406ー
  • DOI: 10.1038/ncomms2420
• [Journal Article] Crystal structure and enzymatic activity of an ADAMTS13 mutant with the East Asian-specific P475S polymorphism. (2013)
  • Author(s): Akiyama M, Nakayama D, Takeda S, Kokame K, Takagi J, Miyata T.
  • Journal Title: J Thromb Haemost. Volume : 11 Pages : 1399ー1406
  • DOI: 10.1111/jth.12279
• [Journal Article] 光―電子相関顕微鏡法～シナプス接着メカニズム解明への応用～. (2013)
  • Author(s): 宮崎直幸；田中宏樹；禾 晃和；高木淳一；岩崎憲治.
  • Journal Title: 生物物理 Volume : 53(4) Pages : 218ー221
  • DOI: 10.2142/biophys.53.218
• [Journal Article] 相関構造解析法による階層をまたがった生命機能の統合的解明 (2013)
  • Author(s): 高木淳一
  • Journal Title: パリティ Volume : 28-07 Pages : 20ー24
• [Presentation] 脳内アミロイドペプチド受容体sorLAの立体構造 (2015)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: 第三回物構研サイエンスフェスタ
  • Place of Presentation: エポカルつくば
  • Year and Date: 2015-03-17
• [Presentation] Boosting the protein production pipeline by the use of custom-made epitope tagging system. (2015)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: WINTech 2015 “Innovation by Synergy of Computational & Synchrotron Radiation Sciences"
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-03-12
• [Presentation] 動物細胞発現系を用いた高品質受容体タンパク質生産とカスタムアフィニティータグシステムの開発 (2015)
  • Author(s): 海津 正賢
  • Organizer: 大阪大学未来戦略機構国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 大阪（梅田）
  • Year and Date: 2015-03-03
• [Presentation] 創薬ターゲットの高品質生産の技術と応用 (2015)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: PDIS最先端セミナー「創薬につなぐ日本の創薬基盤技術」
  • Place of Presentation: 東京国際フォーラム
  • Year and Date: 2015-02-04
• [Presentation] ヒト疾患関連受容体の構造生物学研究における高品質タンパク質生産技術の重要性－「技術開発」と「基礎研究」は車の両輪－ (2015)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: 創薬等PF特別セミナー
  • Place of Presentation: 東北大学
  • Year and Date: 2015-01-16
• [Presentation] Immunological tools to aid recombinant protein production and analysis (2014)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: 第43回日本免疫学会学術集会 テクニカルセミナー
  • Place of Presentation: 京都国際会館
  • Year and Date: 2014-12-10
• [Presentation] 創薬ターゲット蛋白質の生産におけるカスタムアフィニティータグシステム利用の威力 (2014)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会 バイオテクノロジーセミナー
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-26
• [Presentation] 構造解析に向けたc-Metレセプター細胞外蛋白質の高効率生産 (2014)
  • Author(s): 海津 正賢
  • Organizer: 第３７回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] Structural analysis can lead to a discovery of novel biological function -a case with neuronal lipoprotein receptor sorLA- (2014)
  • Author(s): Junichi Takagi
  • Organizer: Seminar on Structural Neuroscience
  • Place of Presentation: Peking University, China
  • Year and Date: 2014-10-31
• [Presentation] Crystal structure of full-length ApoER2 ectodomain in complex with its ligand reelin (2014)
  • Author(s): Hidenori Hirai
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia Conference (Mechanism of Transmembrane Signaling).
  • Place of Presentation: Suzhou, China
  • Year and Date: 2014-10-30
• [Presentation] Use of custom-made epitope tagging system to facilitate receptor structural biology. (2014)
  • Author(s): Junichi Takagi
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia Conference (Mechanism of Transmembrane Signaling).
  • Place of Presentation: Suzhou, China
  • Year and Date: 2014-10-28
• [Presentation] Efficient production of receptor ectodomains for structural analysis (2014)
  • Author(s): Masataka Umitsu
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia Conference (Mechanism of Transmembrane Signaling).
  • Place of Presentation: Suzhou, China
  • Year and Date: 2014-10-27 – 2014-10-31
• [Presentation] 新規アフィニティータグ「PA tag」のループへの挿入による効果的な利用法 (2014)
  • Author(s): 藤井勇樹
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都国際会館
  • Year and Date: 2014-10-16
• [Presentation] 2D hybrid analysis: A new approach to build 3D atomic model from 2D EM image (2014)
  • Author(s): 岩崎憲治
  • Organizer: 第52回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター, 札幌
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] “PA tag”, a versatile affinity tag system that enables one-step affinity purification and high sensitive detection of recombinant proteins from dilute sample (2014)
  • Author(s): 藤井勇樹
  • Organizer: The 28th Annual Symposium of The Protein Society
  • Place of Presentation: Manchester Grand Hyatt, San Diego
  • Year and Date: 2014-07-28
• [Presentation] 創薬ターゲット蛋白質の生産におけるカスタムアフィニティータグシステム利用の威力 (2014)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会 ランチョンセミナー
  • Place of Presentation: ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
  • Year and Date: 2014-06-26
• [Presentation] 電子顕微鏡単粒子解析を用いたDkk1-LRP6複合体の構造解析 (2014)
  • Author(s): 的場 京子
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
  • Year and Date: 2014-06-26
• [Presentation] セマフォリン-プレキシン複合体の電子顕微鏡による解析 (2014)
  • Author(s): 鈴木慶
  • Organizer: 第１４回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
  • Year and Date: 2014-06-26
• [Presentation] ApoER2細胞外領域－リガンド複合体が明らかにするLDLRファミリーのリガンド認識メカニズム (2014)
  • Author(s): 平井秀憲
  • Organizer: 第１4回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
  • Year and Date: 2014-06-26
• [Presentation] 電子顕微鏡画像からの原子モデル構造の構築 (2014)
  • Author(s): 岩崎憲治
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜 / 横浜産貿ホール マリネリア, 横浜
  • Year and Date: 2014-06-25 – 2014-06-27
• [Presentation] コイルドコイル融合による新規Fvフラグメント抗体の開発 (2014)
  • Author(s): 有森貴夫
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
  • Year and Date: 2014-06-25
• [Presentation] 抗PAタグペプチド抗体NZ-1の特異性の改変 (2014)
  • Author(s): 藤井勇樹
  • Organizer: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜/横浜産貿ホール マリネリア
  • Year and Date: 2014-06-25
• [Presentation] ハイブリッドアプローチによる電顕画像からの情報抽出 (2014)
  • Author(s): 岩崎憲治
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第70回記念学術講演会
  • Place of Presentation: 日本顕微鏡学会第70回記念学術講演会
  • Year and Date: 2014-05-11 – 2014-05-13
• [Presentation] アルツハイマー病発症におけるSorLAの役割 (2013)
  • Author(s): 新留 穏香
  • Organizer: 第１２回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取県）
  • Year and Date: 20130612-20130614
• [Presentation] 二次元EMイメージングへの原子構造のフィッティング (2013)
  • Author(s): 岩崎 憲治
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第68回学術講演会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 20130520-20130522
• [Presentation] Expanding the Structural Genomics to Structural Life Science: Not just to answer, but to ask new biological questions
  • Author(s): Junichi Takagi
  • Organizer: International Conference on Structural Genomics 2013 - Structural Life Science
  • Place of Presentation: 札幌京王プラザホテル（北海道）
• [Presentation] Resolution, dynamics, and heterogeneity -In what detail do we need to know protein structures for answering biological questions?
  • Author(s): Junichi Takagi
  • Organizer: Gordon Research Conference (X-ray Science)
  • Place of Presentation: Stonehill Colledge, USA
• [Presentation] Analyzing higher-order architecture of synaptic adhesion machinery: Correlation technologies to fill the gap between different imaging methods
  • Author(s): Junichi Takagi
  • Organizer: 11th International Conference on Biology and Synchrotron Radiation
  • Place of Presentation: Humberg, Germany
• [Presentation] アミロイドクリアランス受容体sorLAの構造
  • Author(s): 高木 淳一
  • Organizer: 千里ライフサイエンスセミナー
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター（大阪府）
• [Presentation] アミロイドクリアランス受容体sorLA/LR11の構造
  • Author(s): 高木 淳一
  • Organizer: 蛋白研セミナー「第４回神経科学と構造生物学の融合研究会」
  • Place of Presentation: 岡崎コンファレンスセンター（愛知県）
• [Presentation] SorLA Vps10pドメインのAβペプチド認識機構
  • Author(s): 北郷 悠
  • Organizer: 第13回日本蛋白質科学会年会、ワークショップ
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取県）
• [Presentation] Molecular basis of peptide ligand recognition by SorLA Vps10p domain
  • Author(s): Yu Kitago
  • Organizer: International Conference on Structural Genomics 2013 - Structural Life Science
  • Place of Presentation: 札幌京王プラザホテル（北海道）
• [Presentation] "PA tag", a novel affinity tag system that enables one-step affinity purification of recombinant proteins from dilute sample
  • Author(s): Yuki Fujii
  • Organizer: International Conference on Structural Genomics 2013 - Structural Life ScienceInternational Conference on Structural Genomics 2013 - Structural Life Science
  • Place of Presentation: 札幌京王プラザホテル（北海道）
• [Remarks] 研究室HP
  • URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/rcsfp/synthesis/index.html
• [Remarks] アルツハイマー病の原因物質を「掃除」するタンパク質の立体構造を解明
  • URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/achievement/papers/sorla-2/
• [Patent(Industrial Property Rights/JSPS)] Wntタンパク質の安定な製造法および保存法
  • Inventor(s): 高木淳一
  • Industrial Property Rights Holder: 高木淳一
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願２０１４－２６０７９２
  • Filing Date: 2014-12-24
  • Application Year: 2014