選択的なポリユビキチン鎖検出・定量法の開発

• Project Area: New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation
• Project/Area Number: 24112008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
• Project Period (FY): 2012-06-28 – 2017-03-31
• Project Status: Granted(Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥146,380,000 (Direct Cost : ¥112,600,000、Indirect Cost : ¥33,780,000); Fiscal Year 2016 : ¥11,180,000 (Direct Cost : ¥8,600,000、Indirect Cost : ¥2,580,000); Fiscal Year 2015 : ¥18,980,000 (Direct Cost : ¥14,600,000、Indirect Cost : ¥4,380,000); Fiscal Year 2014 : ¥11,310,000 (Direct Cost : ¥8,700,000、Indirect Cost : ¥2,610,000); Fiscal Year 2013 : ¥11,180,000 (Direct Cost : ¥8,600,000、Indirect Cost : ¥2,580,000); Fiscal Year 2012 : ¥93,730,000 (Direct Cost : ¥72,100,000、Indirect Cost : ¥21,630,000)
• Keywords: 生体分子 / 蛋白質 / 酵素 / プロテオーム / ユビキチン / プロテアソーム / タンパク質分解 / 質量分析計 / 定量プロテオミクス / アフィニティープローブ

Outline of Annual Research Achievements

ユビキチンシグナルの全貌解明を目的とし、以下の解析を行った。
1. 質量分析によるユビキチン鎖の識別定量法の確立：これまでQ-Q-Orbitrap型質量分析計を用いたPRM（Parallel Reaction Monitoring）法により、全てのユビキチンリンケージを超微量（100 amol）から絶対定量する系を確立し、領域内で見出された重要な基質のユビキチン鎖情報を得てきた。本年度はユビキチンリガーゼUBE3Cが形成するユビキチン鎖、カベオリンに付加するユビキチン鎖等の解析に成功した。一方、領域内で見出されたアセチル化ユビキチン、リン酸化ユビキチンについて、すべての部位に対応したAQUAペプチドを作製し、PRM法による絶対定量法を確立した。
2．ポリユビキチン鎖長決定法の開発：これまで、基質に付加したユビキチン鎖長を決定する新手法Ub-ProT（ubiquitin chain-protection from trypsinization）法を開発してきたが、本年度はEGF受容体に付加するユビキチン鎖に応用し、EGF受容体にはEGF刺激時、平均4～6-merのK63鎖が付加されることが明らかとなった。
3．ユビキチン結合タンパク質の網羅的解析：ユビキチン修飾系のデコーダー分子であるユビキチン結合タンパク質が細胞内で相互作用するユビキチン鎖を網羅的に定量解析することで、細胞内のユビキチン鎖の使い分けを明らかにした。その結果、プロテアソームによるユビキチン化タンパク質の分解経路は、細胞内ではCdc48/p97/VCPとRad23を介したものが主要経路であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2 :  Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ユビキチン鎖およびユビキチンの翻訳後修飾の絶対定量法、ユビキチン鎖長決定法、ユビキチン化基質の網羅的同定法を確立し、領域内における共同研究に発展させている。また、以前より検討していたホルマリン固定サンプルを用いた質量分析解析に成功しつつあり、現在、ユビキチン結合タンパク質やユビキチンリガーゼの基質探索などの応用を試みている。

Strategy for Future Research Activity

計画通り、以下の研究を推進する。
平成27年度に引き続き、質量分析計によるポリユビキチン鎖絶対定量法、修飾ユビキチンの絶対定量法、ユビキチン鎖の鎖長決定法を領域内の重要分子に応用する。また、Middle-down質量分析解析による分岐型ユビキチン鎖の検出・定量法の開発、ユビキチン化基質の網羅的同定法の改良を進め、領域内研究に発展させる。一方、主要なユビキチン結合タンパク質20種類についてはコドン最適化コンストラクトにより大腸菌発現系が容易となったため、各ポリユビキチン鎖（K48鎖、K63鎖、M1鎖）やリン酸化ユビキチン・アセチル化ユビキチンとの直接結合を試験管内で評価する。これらの解析結果を統合することで、ユビキチンシグナル発動のメカニズムを明らかにし、各パスウェイにおけるユビキチン修飾の使い分け、すなわちユビキチンネットワークのドラフトマップを作出する。

Research Products

• [Journal Article] Phosphorylated ubiquitin chain is the genuine Parkin receptor. (2015)
  • Author(s): Okatsu, K., Koyano, F., Kimura, M., Kosako, H., Saeki, Y., Tanaka, K. and Matsuda, N.
  • Journal Title: J. Cell. Biol. Volume : 209 Pages : 111-128
  • DOI: 10.1083/jcb.201410050
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Nedd4-induced mono-ubiquitination of IRS-2 enhances IGF signalling and mitogenic activity. (2015)
  • Author(s): Fukushima, T., Yoshihara, H., Furuta, H., Hakuno F., Luan, J., Duan, C., Saeki, Y., Tanaka, K., Iemura, S-I., Natsume, T., Chida, K., Nakatsu, Y., Kamata, H., Asano, T., and Takahashi, S-I.
  • Journal Title: Nature Commun. Volume : 6 Pages : 6780
  • DOI: 10.1038/ncomms7780
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The E3 ubiquitin ligase TRIM23 regulates adipocyte differentiation via stabilization of the adipogenic activator PPARγ. (2015)
  • Author(s): Watanabe, M., Takahashi, H., Saeki, Y., Ozaki, T., Itoh, S., Suzuki, M., Mizushima, W., Tanaka, K., and Hatakeyama, S.
  • Journal Title: Elife Volume : 4 Pages : e05615
  • DOI: 10.7554/eLife.05615
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Site-specific Interaction Mapping of Phosphorylated Ubiquitin to Uncover Parkin Activation. (2015)
  • Author(s): Yamano. K., Queliconi. B.B., Koyano. F., Saeki. Y., Hirokawa. T., Tanaka. K., and Matsuda. N.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume : 290 Pages : 25199-25211
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.671446
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Liganded ERα stimulates the E3 ubiquitin ligase activity of UBE3C to facilitate cell proliferation. (2015)
  • Author(s): Okada, M., Ohtake, F., Nishikawa, H., Wu, W., Saeki, Y., Tanaka, K., and Ohta, T.
  • Journal Title: Mol. Endocrin. Volume : 29 Pages : 1646-1657
  • DOI: 10.1210/me.2015-1125
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ankrd13 Family of Ubiquitin-interacting Motif-bearing Proteins Regulates VCP/p97-mediated Lysosomal Traffic of Caveolin-1. (2015)
  • Author(s): Burana, D., Yoshihara, H., Tanno, H., Yamamoto, A., Saeki, Y., Tanaka, K., and Komada, M.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume : 291 Pages : 6218-6231
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.710707
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ユビキチンリガーゼ活性の簡便で効率的な検出方法 (2015)
  • Author(s): 吉田雪子, 佐伯 泰, 田中啓二
  • Journal Title: 実験医学 Volume : 33 Pages : 3003-3007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] プロテアソームの作動機構と細胞内動態 (2015)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Journal Title: 生化学 Volume : 87 Pages : 705-722
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2015.870705
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mutations in deubiquitinase USP8 cause Cushing's disease (2015)
  • Author(s): Reincke, M., Sbiera, S., Hayakawa, A., Theodoropoulou, M., Osswald, A., Beuschlein, F., Meitinger, T., Mizuno-Yamasaki, E., Kawaguchi, K., Saeki, Y., Tanaka, K., Wieland, T., Graf, E., Saeger, W., Ronchi, CL., Allolio, B., Buchfelder, M., Strom, TM., Fassnacht, M., and Komada, M.
  • Journal Title: Nature Genetics Volume : 47 Pages : 31-38
  • DOI: 10.1038/ng.3166
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ubiquitin acetylation modulates polyubiquitin chain elongation (2015)
  • Author(s): Ohtake, F., Saeki, Y., Sakamoto, K., Ohtake, K., Nishikawa, H., Tsuchiya, H., Ohta, T., Tanaka, K., and Kanno, J.
  • Journal Title: EMBO Rep. Volume : 16 Pages : 192-201
  • DOI: 10.15252/embr.201439152
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The Unexpected Role of Polyubiquitin Chains in the Formation of Fibrillar Aggregates (2015)
  • Author(s): Morimoto, D., Walinda, E., Fukada, H., Sou, Y-S., Kageyama, S., Hoshino, M., Fujii, T., Tsuchiya, H., Saeki, Y., Arita, K., Ariyoshi, M., Tochio,H., Iwai, K., Namba, K., Komatsu, M., Tanaka, K. and Shirakawa, M.
  • Journal Title: Nature Commun. Volume : 6 Pages : 6116
  • DOI: 10.1038/ncomms7116
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A comprehensive method for detecting ubiquitinated substrates using TR-TUBE (2015)
  • Author(s): Yoshida, Y., Saeki, Y., Murakami, A., Kawawaki, J., Tsuchiya, H., Yoshihara, H., Shindo, M., and Tanaka, K.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume : 112 Pages : 4630-4635
  • DOI: 10.1073/pnas.1422313112
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin (2014)
  • Author(s): Koyano, F., Okatsu, K., Kosako, H., Tamura, Y., Go, E., Kimura, M., Kimura, Y., Tsuchiya, H, Yoshihara, H., Hirokawa, T., Endo, T., Fon, E.A., Trempe, J., Saeki, Y., Tanaka, K. and Matsuda, N.
  • Journal Title: Nature Volume : 510 Pages : 162-166
  • DOI: 10.1038/nature13392
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Pba3-Pba4 heterodimer acts as a molecular matchmaker in proteasome α-ring formation (2014)
  • Author(s): Takagi, K., Saeki, Y., Yashiroda, H., Yagi, H., Kaiho, A., Murata, S., Yamane, T., Tanaka, K., Mizushima, T. and Kato, K.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume : 450 Pages : 1110-1114
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.06.119
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Suppression of LUBAC-mediated linear ubiquitination by a specific interaction between LUBAC and the deubiquitinases CYLD and OTULIN. (2014)
  • Author(s): Takiuchi, T., Nakagawa, T., Tamiya, H., Fujita, H., Sasaki, Y., Saeki, Y., Takeda, H., Sawasaki, T., Buchberger, A., Kimura, T., and Iwai, K.
  • Journal Title: Genes Cells Volume : 19 Pages : 254-272
  • DOI: 10.1111/gtc.12128.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative live-cell imaging reveals spatio-temporal dynamics and cytoplasmic assembly of the 26S proteasome (2014)
  • Author(s): Pack, CG., Yukii, H., Toh-e, A., Kudo, T., Tsuchiya, H., Kaiho, A., Sakata, E., Murata, S., Sako, Y., Baumeister, W., Tanaka, K., and Saeki, Y.
  • Journal Title: Nature Commun Volume : 5 Pages : 3396
  • DOI: 10.1038/ncomms4396.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of proteasome formation controlled by an assembly chaperone Nas2 (2014)
  • Author(s): Satoh, T., Saeki, Y., Hiromoto, T., Wang, Y., Uekusa, Y., Yagi, H., Yoshihara, H., Yagi-Utsumi, M., Mizushima, T., Tanaka, K. and Kato, K.
  • Journal Title: Structure Volume : 22 Pages : 731-743
  • DOI: 10.1016/j.str.2014.02.014.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate Parkin (2014)
  • Author(s): Koyano, F., Okatsu, K., Kosako, H., Tamura, Y., Go, E., Kimura, M., Kimura, Y., Tsuchiya, H., Yoshihara, H., Hirokawa, T., Endo, T., Fon, E.A., Trempe, J., Saeki, Y., Tanaka, K. and Matsuda, N.
  • Journal Title: Nature Volume : 印刷中 Pages : 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ユビキチンネットワークの全容解明を目指して (2015)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 平成27年度日本生化学会関東支部例会
  • Place of Presentation: 新潟日報メディアシップ（新潟県新潟市）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-20
  • Invited
• [Presentation] ユビキチンコードの全容解明を目指して (2015)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 日本農芸化学会2015大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 岡山大学（岡山）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
  • Invited
• [Presentation] Elucidating the proteasome dynamics and cellular ubiquitin code (2014)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: The 5th International Symposium on Life Science in Toyama
  • Place of Presentation: 富山大学（富山）
  • Year and Date: 2014-12-11 – 2014-12-11
  • Invited
• [Presentation] A comprehensive analysis of ubiquitin linkages and length specificities of ubiquitin-binding proteins (2014)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: 1st International Meeting for New Aspects of the Ubiquitin Research
  • Place of Presentation: 国際高等研究所レクチャーホール（京都）
  • Year and Date: 2014-11-10 – 2014-11-10
  • Invited
• [Presentation] 細胞内ポリユビキチン化タンパク質の鎖長制御機構 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰、土屋 光、吉原英人、田中啓二
  • Organizer: 第36回 日本分子生物学会年会ワークショップ
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 20131205-20131205
  • Invited
• [Presentation] A method to determine the chain length of the polyubiqutinated proteins (2013)
  • Author(s): Hikaru Tsuchia, Keiji Tanaka, and Yasushi Saeki
  • Organizer: EMBO Conference on Ubiquitin and ubiquitin-like proteins “From structure to function”
  • Place of Presentation: Riva der Garda, Italy
  • Year and Date: 20131001-20131005
• [Presentation] Absolute quantification of ubiquitin-linkages and ubiquitin-binding proteins by parallel reaction monitoring from biological complex samples (2013)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: HUPO2013
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130917-20130917
  • Invited
• [Presentation] ユビキチンコード解析法の開発 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰、土屋 光、田中啓二
  • Organizer: 第86回 日本生化学会大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130912-20130912
  • Invited
• [Presentation] ユビキチンコード解析法の開発 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰、土屋 光、田中啓二
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第46回研究報告会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 20130908-20130908
• [Presentation] ユビキチンコード解析法とプロテアソーム研究の最前線 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 東京工業大学フロンティア研究機構セミナー
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20130830-20130830
  • Invited
• [Presentation] A method to determine the chain length of the polyubiqutinated proteins (2013)
  • Author(s): Hikaru Tscuchiya, Yasushi Saeki, Ai Kaiho, Keiji Tanaka, and Tetsu Akiyama
  • Organizer: The 35th Natio Conference “The Ubiquitin-Proteasome System: From Basic Mechanisms to Pathophysiological Roles”
  • Place of Presentation: Sapporo, Japan
  • Year and Date: 20130709-20130712
  • Invited
• [Presentation] Ub-ProT: A novel method to determine the chain length of the polyubiquitylated proteins. (2013)
  • Author(s): Yasushi Saeki, Hikaru Tsuchiya, Ai Kaiho, and Keiji Tanaka
  • Organizer: 4th IGAKUKEN International Symposium on“Cutting-edge of the Ubiquitin Proteasome System”
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20130708-20130708
  • Invited
• [Book] 実験医学・増刊号「構造生命科学－構造を使う研究を目指す新しいライフサイエンス」 (2014)
  • Author(s): 佐伯 泰、水島恒裕
  • Total Pages: ７
  • Publisher: 羊土社
• [Book] 細胞工学Hot Press (2014)
  • Author(s): 佐伯 泰、白 燦基
  • Total Pages: ２
  • Publisher: 秀潤社
• [Remarks] 蛋白質代謝研究室ホームページ
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/pro-meta/
• [Remarks] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/pro-meta/
• [Remarks] ユビキチン化基質の効率的な同定法の開発
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2015/0331.html
• [Remarks] 難病"クッシング病"の原因遺伝子と発症機構を解明
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2014/1209.html
• [Patent(Industrial Property Rights)] A method for determining Ubiquitin chain length (2014)
  • Inventor(s): Yasushi Saeki et al
  • Industrial Property Rights Holder: Yasushi Saeki et al
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 14/533,182
  • Filing Date: 2014-11-05
  • Application Year: 2014
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] パーキンソン病のバイオマーカーおよびその利用 (2014)
  • Inventor(s): 松田憲之、小谷野史香、尾勝圭、呉越、木村まゆみ、佐伯泰
  • Industrial Property Rights Holder: 松田憲之、小谷野史香、尾勝圭、呉越、木村まゆみ、佐伯泰
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2014-028449
  • Filing Date: 2014-02-18
  • Application Year: 2014
• [Patent(Industrial Property Rights)] ポリユビキチン化基質の同定方法 (2013)
  • Inventor(s): 吉田雪子、佐伯 泰、土屋 光、村上有沙、田中啓二
  • Industrial Property Rights Holder: 吉田雪子、佐伯 泰、土屋 光、村上有沙、田中啓二
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2013-237362
  • Filing Date: 2013-11-15
  • Application Year: 2013