選択的なポリユビキチン鎖検出・定量法の開発

• Project Area: New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation
• Project/Area Number: 24112008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
• Project Fiscal Year: 2012-06-28 – 2017-03-31
• Project Status: Granted(Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥146,380,000 (Direct Cost : ¥112,600,000、Indirect Cost : ¥33,780,000); Fiscal Year 2016 : ¥11,180,000 (Direct Cost : ¥8,600,000、Indirect Cost : ¥2,580,000); Fiscal Year 2015 : ¥18,980,000 (Direct Cost : ¥14,600,000、Indirect Cost : ¥4,380,000); Fiscal Year 2014 : ¥11,310,000 (Direct Cost : ¥8,700,000、Indirect Cost : ¥2,610,000); Fiscal Year 2013 : ¥11,180,000 (Direct Cost : ¥8,600,000、Indirect Cost : ¥2,580,000); Fiscal Year 2012 : ¥93,730,000 (Direct Cost : ¥72,100,000、Indirect Cost : ¥21,630,000)
• Keywords: 生体分子 / 蛋白質 / 酵素 / プロテオーム / ユビキチン / プロテアソーム / タンパク質分解 / 質量分析計 / 定量プロテオミクス / アフィニティープローブ

Outline of Annual Research Achievements

ユビキチンシグナルの全貌解明を目的とし、以下の解析を行った。
1. 質量分析によるユビキチン鎖の識別定量法の確立：生体内では8種類の異なるユビキチン鎖リンケージが存在するが、Q-Q-Orbitrap型質量分析計を用いたPRM（Parallel Reaction Monitoring）法により、複雑試料から全てのユビキチンリンケージを超微量（100 amol）から定量する系を確立し、細胞内で生成するユビキチンシグナルを内在性の発現レベルで解析することが可能となった。次いで、ユビキチン修飾系のデコーダー分子ユビキチン結合タンパク質について細胞内で相互作用するユビキチン鎖を網羅的に定量解析することで、細胞内のユビキチン鎖の使い分けを明らかにした。一方、領域内で見出されたアセチル化ユビキチン、リン酸化ユビキチンについてもPRM法による絶対定量法を確立し論文として発表した。
2．ポリユビキチン鎖長決定法の開発：基質に付加したユビキチン鎖長を決定する新手法Ub-ProT（ubiquitin chain-protection from trypsinization）法を確立し、PRM法によるユビキチン鎖の絶対定量法を組み合わせることで、細胞内に存在する各ポリユビキチン鎖の平均鎖長を決定した。
3．ユビキチン化基質の網羅解析
ユビキチン鎖に対する新規アフィニティープローブTR-TUBE（trypsin resistant-tandem ubiquitin binding entity）と抗ユビキチン化ペプチド抗体を用いて、ユビキチン化基質の網羅的同定に成功し論文として発表した。

Current Status of Research Progress

Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ユビキチン鎖およびユビキチンの翻訳後修飾の絶対定量法、ユビキチン鎖の長さ、ユビキチン化基質の網羅的同定法を既に確立し、順次、領域内研究者の研究に応用している。平成26年度の中間評価（全体評価A）において「研究の進展は順調であり、高感度質量分析によるユビキチン鎖の新規解析を担当することで本領域の要の一つとなっている。」と評されたとおり、領域の発展に貢献している。

Research Output

• [Journal Article] Mutations in deubiquitinase USP8 cause Cushing's disease (2015)
  • Author(s): Reincke, M., Sbiera, S., Hayakawa, A., Theodoropoulou, M., Osswald, A., Beuschlein, F., Meitinger, T., Mizuno-Yamasaki, E., Kawaguchi, K., Saeki, Y., Tanaka, K., Wieland, T., Graf, E., Saeger, W., Ronchi, CL., Allolio, B., Buchfelder, M., Strom, TM., Fassnacht, M., and Komada, M.
  • Journal Title: Nature Genetics Volume : 47 Pages : 31-38
  • DOI: 10.1038/ng.3166
• [Journal Article] Ubiquitin acetylation modulates polyubiquitin chain elongation (2015)
  • Author(s): Ohtake, F., Saeki, Y., Sakamoto, K., Ohtake, K., Nishikawa, H., Tsuchiya, H., Ohta, T., Tanaka, K., and Kanno, J.
  • Journal Title: EMBO Rep. Volume : 16 Pages : 192-201
  • DOI: 10.15252/embr.201439152
• [Journal Article] The Unexpected Role of Polyubiquitin Chains in the Formation of Fibrillar Aggregates (2015)
  • Author(s): Morimoto, D., Walinda, E., Fukada, H., Sou, Y-S., Kageyama, S., Hoshino, M., Fujii, T., Tsuchiya, H., Saeki, Y., Arita, K., Ariyoshi, M., Tochio,H., Iwai, K., Namba, K., Komatsu, M., Tanaka, K. and Shirakawa, M.
  • Journal Title: Nature Commun. Volume : 6 Pages : 6116
  • DOI: 10.1038/ncomms7116
• [Journal Article] A comprehensive method for detecting ubiquitinated substrates using TR-TUBE (2015)
  • Author(s): Yoshida, Y., Saeki, Y., Murakami, A., Kawawaki, J., Tsuchiya, H., Yoshihara, H., Shindo, M., and Tanaka, K.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume : 112 Pages : 4630-4635
  • DOI: 10.1073/pnas.1422313112
• [Journal Article] Suppression of LUBAC-mediated linear ubiquitination by a specific interaction between LUBAC and the deubiquitinases CYLD and OTULIN. (2014)
  • Author(s): Takiuchi, T., Nakagawa, T., Tamiya, H., Fujita, H., Sasaki, Y., Saeki, Y., Takeda, H., Sawasaki, T., Buchberger, A., Kimura, T., and Iwai, K.
  • Journal Title: Genes Cells Volume : 19 Pages : 254-272
  • DOI: 10.1111/gtc.12128.
• [Journal Article] Quantitative live-cell imaging reveals spatio-temporal dynamics and cytoplasmic assembly of the 26S proteasome (2014)
  • Author(s): Pack, CG., Yukii, H., Toh-e, A., Kudo, T., Tsuchiya, H., Kaiho, A., Sakata, E., Murata, S., Sako, Y., Baumeister, W., Tanaka, K., and Saeki, Y.
  • Journal Title: Nature Commun Volume : 5 Pages : 3396
  • DOI: 10.1038/ncomms4396.
• [Journal Article] Structural basis of proteasome formation controlled by an assembly chaperone Nas2 (2014)
  • Author(s): Satoh, T., Saeki, Y., Hiromoto, T., Wang, Y., Uekusa, Y., Yagi, H., Yoshihara, H., Yagi-Utsumi, M., Mizushima, T., Tanaka, K. and Kato, K.
  • Journal Title: Structure Volume : 22 Pages : 731-743
  • DOI: 10.1016/j.str.2014.02.014.
• [Journal Article] Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate Parkin (2014)
  • Author(s): Koyano, F., Okatsu, K., Kosako, H., Tamura, Y., Go, E., Kimura, M., Kimura, Y., Tsuchiya, H., Yoshihara, H., Hirokawa, T., Endo, T., Fon, E.A., Trempe, J., Saeki, Y., Tanaka, K. and Matsuda, N.
  • Journal Title: Nature Volume : 印刷中 Pages : 印刷中
• [Journal Article] Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin (2014)
  • Author(s): Koyano, F., Okatsu, K., Kosako, H., Tamura, Y., Go, E., Kimura, M., Kimura, Y., Tsuchiya, H, Yoshihara, H., Hirokawa, T., Endo, T., Fon, E.A., Trempe, J., Saeki, Y., Tanaka, K. and Matsuda, N.
  • Journal Title: Nature Volume : 510 Pages : 162-166
  • DOI: 10.1038/nature13392
• [Journal Article] Pba3-Pba4 heterodimer acts as a molecular matchmaker in proteasome α-ring formation (2014)
  • Author(s): Takagi, K., Saeki, Y., Yashiroda, H., Yagi, H., Kaiho, A., Murata, S., Yamane, T., Tanaka, K., Mizushima, T. and Kato, K.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume : 450 Pages : 1110-1114
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.06.119
• [Presentation] ユビキチンコードの全容解明を目指して (2015)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 日本農芸化学会2015大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 岡山大学（岡山）
• [Presentation] Elucidating the proteasome dynamics and cellular ubiquitin code (2014)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: The 5th International Symposium on Life Science in Toyama
  • Place of Presentation: 富山大学（富山）
• [Presentation] A comprehensive analysis of ubiquitin linkages and length specificities of ubiquitin-binding proteins (2014)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: 1st International Meeting for New Aspects of the Ubiquitin Research
  • Place of Presentation: 国際高等研究所レクチャーホール（京都）
• [Presentation] 細胞内ポリユビキチン化タンパク質の鎖長制御機構 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰、土屋 光、吉原英人、田中啓二
  • Organizer: 第36回 日本分子生物学会年会ワークショップ
  • Place of Presentation: 神戸
• [Presentation] A method to determine the chain length of the polyubiqutinated proteins (2013)
  • Author(s): Hikaru Tsuchia, Keiji Tanaka, and Yasushi Saeki
  • Organizer: EMBO Conference on Ubiquitin and ubiquitin-like proteins “From structure to function”
  • Place of Presentation: Riva der Garda, Italy
• [Presentation] Absolute quantification of ubiquitin-linkages and ubiquitin-binding proteins by parallel reaction monitoring from biological complex samples (2013)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: HUPO2013
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] ユビキチンコード解析法の開発 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰、土屋 光、田中啓二
  • Organizer: 第86回 日本生化学会大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] ユビキチンコード解析法の開発 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰、土屋 光、田中啓二
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第46回研究報告会
  • Place of Presentation: 仙台
• [Presentation] ユビキチンコード解析法とプロテアソーム研究の最前線 (2013)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 東京工業大学フロンティア研究機構セミナー
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] A method to determine the chain length of the polyubiqutinated proteins (2013)
  • Author(s): Hikaru Tscuchiya, Yasushi Saeki, Ai Kaiho, Keiji Tanaka, and Tetsu Akiyama
  • Organizer: The 35th Natio Conference “The Ubiquitin-Proteasome System: From Basic Mechanisms to Pathophysiological Roles”
  • Place of Presentation: Sapporo, Japan
• [Presentation] Ub-ProT: A novel method to determine the chain length of the polyubiquitylated proteins. (2013)
  • Author(s): Yasushi Saeki, Hikaru Tsuchiya, Ai Kaiho, and Keiji Tanaka
  • Organizer: 4th IGAKUKEN International Symposium on“Cutting-edge of the Ubiquitin Proteasome System”
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
• [Book] 実験医学・増刊号「構造生命科学－構造を使う研究を目指す新しいライフサイエンス」 (2014)
  • Author(s): 佐伯 泰、水島恒裕
  • Total Pages: ７
  • Publisher: 羊土社
• [Book] 細胞工学Hot Press (2014)
  • Author(s): 佐伯 泰、白 燦基
  • Total Pages: ２
  • Publisher: 秀潤社
• [Remarks] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/pro-meta/
• [Remarks] ユビキチン化基質の効率的な同定法の開発
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2015/0331.html
• [Remarks] 難病"クッシング病"の原因遺伝子と発症機構を解明
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2014/1209.html
• [Patent(Industrial Property Rights/JSPS)] ポリユビキチン化基質の同定方法
  • Inventor(s): 吉田雪子、佐伯 泰、土屋 光、村上有沙、田中啓二
  • Industrial Property Rights Holder: 吉田雪子、佐伯 泰、土屋 光、村上有沙、田中啓二
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2013-237362
  • Filing Date: 2013-11-15
  • Application Year: 2013
• [Patent(Industrial Property Rights/JSPS)] パーキンソン病のバイオマーカーおよびその利用
  • Inventor(s): 松田憲之、小谷野史香、尾勝圭、呉越、木村まゆみ、佐伯泰
  • Industrial Property Rights Holder: 松田憲之、小谷野史香、尾勝圭、呉越、木村まゆみ、佐伯泰
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2014-028449
  • Filing Date: 2014-02-18
  • Application Year: 2014
• [Patent(Industrial Property Rights/JSPS)] A method for determining Ubiquitin chain length
  • Inventor(s): Yasushi Saeki et al
  • Industrial Property Rights Holder: Yasushi Saeki et al
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 14/533,182
  • Filing Date: 2014-11-05
  • Application Year: 2014